1105 非無菌產品微生物限度檢查:微生物計數法

微生物計數法系用于能在有氣條件下生長的啫溫細菌和真菌的計數。

當本法用于檢查非無菡制劑及其原、輔料等是否符合規定的微生物限度標準時，應按下述規定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結果的判斷等。除另有規走外，本法不適用于活菌制劑的檢查。

微生物計數試驗環境應符合微生物限度檢查的要求。檢驗全過程必須嚴格道守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。潔凈空氣區域、工作臺面及環境應定期進行監測。

如供試品有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。

供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

計數方法

計數方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數法(Most-Probable-Number Method,簡稱MPN法)。MPN法用于微生物計數時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。

供試品檢查時，應根據供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數方法，檢測的樣品量應能保證所獲得的試驗結果能夠判斷供試品是否符合規定，所選方法的適用性須經確認。

計數培養基適用性檢查和供試品計數方法適用性試驗

供試品微生物計數中所使用的培養基應進行適用性檢查。

供試品的微生物計數方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產品的微生物計數。

若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，計數方法應重新進行適用性試驗。

菌種及菌液制備

菌種 試驗用菌株的傳代次數不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代)，并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。計數培養基適用性檢查和計數方法適用性試驗用菌株見表1

菌液制備 按表1規定程序培養名試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物,用pH7.0無菌氣化鈉-蛋白際緩沖液或0.9%無菌氣化鈉溶液制成適宣濃度的菌懸液;取黑曲蛋的新鮮培養物加入適量含0.05%(m/ml)駿山梨配80的pH7.0無菌氣化鈉-蛋自陳緩沖液或含0.05%(ml/ml)聚山梨醋80的0.9%無菌氣化鈉溶液,將孢子洗脫，然后，采用適宜的方法吸出孢子懸波至無菌試管內，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菡氣化鈉-蛋自陳緩沖液或含0.05%(m/m|)聚山梨酷80的0.9%無菌氣化溶液制或適宜濃度的黑曲蛋孢子懸液。

菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用;若保存在2~8℃,可在24小時內使用。黑曲蛋孢子是波可保存在2~8℃，在驗證過的貯存期內使用。

陰性對照

為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

培養基適用性檢查

微生物計數用的商品化的預制培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應進行培養基適用性檢查。

按表1規定，接種不大于100cfu的菌液至胰酶大豆胨液體培養基管或胰酪大豆陳瓊脂培養基平板或沙氏葡萄糟瓊脂培養基平板，置表1規定條件下培養。每一試驗菌株平行制備2管或2個平板。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。

被檢固體培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值應在0.5~ 2范圍內,且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致;被檢液體培養基管與對照培養基管比較，試驗菌應生長良好。

計數方法適用性試驗

1.供試液制備

根據供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法制備供試液，供試:液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45℃，供試液從制備至加入檢驗用培養基，不得超過1小時。

常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經確認均不適用，應建立其他適宜的方法。

水溶性供試品 取供試品,用pH7.0無菌氣化鈉-蛋自胨緩沖液,或pH7.2磷酸鹽緩沖中液，或胰酯大豆陳液體培養基溶解或稀釋制成1:10供試液。著需要，調節供試液pH值至6~8，必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

水不溶性非油脂類供試品 取供試品,用pH7.0無菌氣化鈉-蛋白陳緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩,沖液，或胰酯大豆陳液體培養基制備成1:10供試液，分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%6(m/ml)的聚山梨醋80，使供試品分散均勻。若需要,調節供試液pH值至6~8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。

油脂類供試品 取供試品，加入無菌十四烷酸異丙醋使溶解，或與最少是并能使供試品乳化的無菌聚山梨醒80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40℃(特殊情況下，最多不超過45”℃),小心混臺,若需要可在水浴中進行,然后加入預熱的稀釋液使成1:10供試液，保溫，混臺，并在最短時間內形成乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進一步10倍系列稀釋。

膜劑供試品 取供試品，剪碎，加oH7.0無菌氣化鈉-蛋自陳緩沖液，或pH7.2磁酸鹽緩沖液，或建韻大豆陳液體培養墓，漫泡，振猩，制成1:10的供試液。若需要，調節供試液pH值至6~8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。

腸溶及結腸溶制劑供試品 取供試品，加入pH6.8無菌磷酸鹽緩)中液(用于腸溶制劑)或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(用于結腸溶制劑)，置45℃水浴中，振搖，使溶解，制成1:10的供試液。必要時，用同一釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。

氣霧劑供試品 取供試品，置-20℃或其他適宜溫度冷凍約1小時，取出,迅速消毒供試品開啟部位或閥門。正置容器，用無菌鋼錐或針樣設備在與閥門結構相匹配的適宜位置鉆一小孔，供試品各容器的鉆孔大小和深度應盡是保持一致,拔出鋼錐時應無明顯拋射劑拋出，輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩釋出。亦可采用專用設備釋出拋射劑，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，并將供試品轉移至無菌容器中混合,必要時用沖洗液沖洗容器內壁。供試品亦可采用其他適直的方法取出，然后取樣檢查。

貼劑、貼營劑供試品 取供試品，去掉防粘層，將枯貼面朝上放置在無菌玻璃成塑料器皿上，在枯貼面上要蓋一層適宜的無菌多孔材料(如無菌到布)，避免供試品粘貼在一起。將處理后的供試品放入盛有適宜體積并含有表面活性劑(如駿山梨酯80或卵磷脂)稀釋液的容器中，振蕩至少30分鐘，必要時，用同-稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。

2. 接種和稀釋

按表1規定及下列要求進行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液，所加菌波的體積應不超過供試液體積的1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出，首先應選擇最低稀釋級的供試液進行計數方法適用性試驗。

試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1m|供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。

供試品對照組 取制備好的供試液，以稀擇液代替菌液同試驗組操作。

菌液對照組 取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因導致無法選擇最低稀釋級的供試液進行方法適用性試驗時，應采用適直的方法對供試液進行進一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適用性試驗。

3.抗菌活性的去除或滅活

供試液接種后，按下列"微生物回收"規定的方法進行微生物計數。若試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值小于菌液對照組菌落數值的50%,可采用下述方法消除供試品的抑菌活性，

(1)增加稀釋液或培養基體積。

(2)加入適直的中和劑或滅活劑

中和劑或滅活劑(表2)可用于消除干擾物的抑菌活性,最好在稀釋液或培養基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗中應設中和劑或滅活劑對照組，即取相應量含中和劑或滅活劑的稀釋液替代供試品同試驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒性。中和劑或滅活劑對照組的菌落數與菌液對照組的菌落數的比值應在0.5~2范圍內。

(3)采用薄膜過濾法

(4)上述幾種方法的聯合使用

若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗菌回收的失敗，表明供試品對該試驗菌具有較強抗菌活性，同時也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限應標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數方法適用性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢查。

4.供試品中微生物的回收

表1所列的計數方法適用性試驗用的各試驗菌應逐一進行微生物回收試驗。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。

(1) 平皿法 平Ⅲ法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗菌每種培養基至少制備2個平皿，以算術平均值作為計數結果。

傾注法 取照上述"供試液的制備“"接種和稀釋"和"抗菌活性的去除或滅活"制備的供試液1ml,晉直徑90mm的無菌平皿中,注入15~20m!溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆陳瓊脂或沙氏葡萄糖瓊臘培養基，混勻，凝固，倒置培養。若使用直徑較大的平皿,培養基的用是應相應增加。按表1規定條件培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各試驗組的平均菌落數。

涂布法 取適量(通常為15~20m)溫度不超過45“的胰酪大豆陳瓊臘或沙氏帶萄糖瓊臘培養華,注入直徑90mm的無菌平皿,凝固，制成平板采用適宜的方法使培養基表面干燥。若使用直徑較大的平皿,培養基用是也應相應增加。每一平板表面接種上述照"供試液的制備""接種和稀釋"和"抗榮活件的去除或滅活"制備的供試液不少于0.1m1，按表1規宗條件培養、計數，同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數，計算名試驗組的平均菌落數。

(2) 薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應不大于0.45um，直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整。供試品及其溶劑應不影響濾膜材質對微生物的截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液要蓋整個濾膜表面，供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液,沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100m1，總沖洗量一般不超過500m!，最多不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。

取照上述"供試液的制備“"接種和稀釋”和"抗菌活性的去除或滅活"制備的供試液適量(一般取相當于1g、1ml或10cm'的供試品，若供試品中所含的菌數較多時，供試液可的情減量)，加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。

若測定需氣菌總數，轉移濾膜菌面朝上貼于胰酶大豆胨瓊臘培養基平板上;若測定毒苗和酵母總數，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上。按表1規定條件培養、計數，每株試驗菌每種培養基至少制備一張濾膜，同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。

(3)MPN法 MPN法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數法，僅在供試品需氣菌總數沒有適直計數方法的情況下使用，本法不適用于要菡計數。若使用MPN法，按下列步躲進行。

取照上述"供試液的制備“"接種和稀釋"和"抗菌活性的去除或滅活"制備的供試液至少3個連續稀釋級,每一樣釋級取3份1ml分別接種至3管裝有9~10ml眭酪大豆陳液體培養基中，同法測定菌液對照組菌數。必要時可在培養基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。

接種管晉30~35℃培養不超過3天，逐日觀賓各管微生物生長情況，如果由于供試品的原因使得結果難以判斷，可將該管培養物轉種至胰酪大豆胨液體培養基或胰酯大豆胨瓊脂培養基，在相同條件下培養1~2天,觀家是否有微生物生長。根據微生物生長的管數從表3查被測供試品1g、1ml或10cm'中需氣菌總數的最可能數。

5.結果判斷

計數方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5~2范用內;采用MPN法時，試驗組菌數應在菌液對照組菌數的95%置信限內，若各試驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數方法進行該供試品的需氣菌總數、番菌和酵母菌總數計數。

方法適用性確認時，若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。

供試品檢查

檢驗量

檢驗量即一次試驗所用的供試品量(g、ml或cm')。

一般應隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取規定量供試品進行檢驗。

除另有規定外，一般供試品的檢驗量為10g或10m;膜劑、貼劑和貼育劑為100cm。檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑、貼劑和貼育劑還不得少于4片。

貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。若供試品處方中每一劑量單位(如片劑、膠囊劑)活性物質含量小于或等于1mg，或每1g或每1m(指制劑)活性物質會量低于1mg時，檢驗是應不少于10個劑量單位或10g或10m|供試品;若樣品量有限或批產星極小(如:小于1000ml或1000g)的活性物質供試品，除另有規定外，其檢驗是最少為批產量的1%，檢驗量更少時需要進行風險評估;若批產量少于200的供試品，檢驗是可減少至2個單位;批產量少于100的供試品，檢驗量可減少至1個單位。

供試品的檢查

按計數方法適用性試驗確認的計數方法進行供試品中需氣菌總數、霍菌和酵母菌總數的測定。

胰酪大豆胨液體培養基或胰酯大豆胨瓊脂培養基用于測定需氣菌總數;

沙氏葡萄糟瓊脂培養基用于測定蛋菌和酵母菌總數

陰性對照試驗 以稀釋液代替供試液進行陰性對照試驗，明性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行差調查。

1.平皿法

平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規定外，取規定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數測定，每稀釋級每種培養基至少制備2個平板。

培養和計數 除另有規定外，胰酪大豆胨瓊脂培養基平板在30~35℃培養3~5天,沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板在20~25℃培養5~7天，觀索菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數,計數并報告。菌落莫延生長成片的平板不直計數。點計菌落數后,計算各稀釋級供試液的平均菌落數,按菡數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落數平均值不小于15，則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。

菌數報告規則 需氣菌總數測定直選取平均菌落數小于300cfu的稀釋級、蛋菌和酵母菌總數測定宜選取平均菌落數小于100cf的稀釋級，作為菌數授告的依據。取最高的平均菌落數，計算19、1ml或10cm“供試品中所含的微生物數，取兩位有效數字報告。

如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數小于1時，以<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。

2.薄膜過濾法

除另有規定外，按計數方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備。取相當于19、1ml或10cm“供試品的供試液,著供試品所會的菌數較多時，可取適宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確認的方法加至適量稀釋液中，立即過濾,沖洗,沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糟瓊脂培養基上培養。

培養和計數 培養條件和計數方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數應不超過100cfu。

菌數報告規則 以相當于1g、1ml或10cm“供試品的菌落數報告菌數;若濾膜上無菌落生長,以<1報告菌數(每張濾膜過濾1g、1ml或10cm'供試品)，或<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。

3.MPN法

取規定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和供試品接種，所有試驗管在30~35℃培養3~5天，如果需要確認是否有微生物生長，按方法適用性試驗確定的方法進行。記錄每一稀釋級微生物生長的管數，從表3查每19、1ml或10cm“供試品中需氣菌總數的最可能數。

結果判斷

需氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基上生長的總菌落數(包括真菌菌落數);蛋菌和酵母菌總數是指沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的總菌落數(包括細菌菌落數)。若國沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的細菌使蛋苗和酵母菌的計數結果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素(如氨重素、慶大蛋素)的沙氏葡萄糖瓊脂培養基或其他選擇性培養基(如玫瑰紅鈉瓊脂培養基)進行毒菌和酵母菌總數測定。使用選擇性培養基時，應進行培養基適用性檢查，若采用MPN法，測主結果為需氣菌總數。

各品種項下規定的微生物限度標準解釋如下

若供試品的需氣菌總數、蛋菌和酶母菌總數的檢查結果均符合該品種項下的規定，判供試品符合規定;若其中任何一項不符合該品種項下的規定，判供試品不符合規定。

稀釋液、沖洗液及培養基

見非無菌產品微生物限度檢查:控制菌檢查法(通則1106)。