9251細菌內毒素檢查法應用指導原則

本指導原則是對細菌內毒素檢查法的內容及應用做進一步的說明，

1.細菌內毒素限值的設定

產品的細菌內毒素限值一般是通過公式L=K/M計算得到的。其中M為人用每千克體重每小時最大供試品劑量,可參考藥品說明書或具有權威性資料的用法用量。

制定品種細菌內毒素限值時，應考慮以下情況。

(1)聯合用藥應考慮慧他制劑可能引入的細菌內毒素;兒科用藥、營養不良用藥和惡病質用藥等,應考慮細前內毒毒對體弱患者人群可能導致更嚴重的影響。因此，制定上述品種細菌內毒素限值時，可在計算值的基礎上適當嚴格。

(2)100ml及以上裝量的大輸液類制劑，其細菌內毒素限值一般不得超過0.50EU/ml。

(3)制定具有多種規格注射液的細菌內毒素限值時,限值的單位應與產品臨床用法用量(M)的標示單位一致,如EU/mg、EU/或EU/ml。

(4)制定原料藥的細菌內毒素限值時，應參考其制劑的細菌內毒素限值。

2.細菌內毒素檢查方法的選擇

細菌內毒素檢育法(通則1143)包括凝膠法和光度法共6種細菌內毒素檢査方法。供試品檢測時可以選用其中任何一種方法進行細菌內毒素檢查。

（1）凝膠法 凝膠法的優點是操作簡便，供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法進行檢驗。凝膠法的干擾試驗是確定供試品能否使用凝膠法的決定因素。進行干擾實驗時，應挑選與堂試劑反應呈陰性的樣品進行若樣品稀釋到MVD仍不能排除干擾作用，應進一步對供試品的前處理進行研究，再用干擾試驗驗證能否使用凝膠法。

（2）光度法 光度法(包括濁度法和顯色法)可定量檢測內毒素的含量,能較為準確評估產品在生產過程中污染的相對風險,定量檢測的數據不僅有利于追蹤產品質量趨勢，還能起到風險預警的作用，達到數據完整性的要求。

供試品能否采用光度法進行檢測，須通過干擾試驗確定。光度測定法可通過回收率判斷出干擾的趨勢，尤其對于研究性質的樣品(如新產品)更具有優勢。

由于光度法的檢測范圍比凝膠法寬，使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數，對于部分使用凝膠法無法排除干擾的樣品，可以嘗試使用光度法建立細菌內毒素檢測方法。

3.供試品的前處理方法

除另有規定外，一般應使用內毒素檢查用水溶解樣品進行細菌內毒素檢查。

在水中溶解度低的樣品可以采取超聲波、加熱助溶、添加助溶劑、調節pH等方法提高其溶解度。當采用適宜的有機溶劑(乙醇、DMSO等)進行溶解時，必須進行干擾試驗驗證內毒素的回收。采用包合技術的新型制劑如微球、脂質體等供試品，應采取適官方法將包合體破壞，使包裹在內部的細菌內毒素完全釋放，再進行檢測。

4.產品細菌內毒素檢查法的建立

建立品種的細菌內毒素檢査法時，為驗證樣品和不同生產廠家鱟試劑反應的一致性，應使用兩個生產廠家的鱟試劑對至少三批樣品進行干擾試驗。建立產品細菌內毒素檢査法時,若無法排除供試品對細菌內毒素檢査的干擾作用,或只能使用最高靈敏度鱟試劑(凝膠法為0.03EU/ml，光度法為0.001EU/m|)才能排除干擾，則該品種不宜建立細菌內毒毒檢查項.

5.其他

實驗時，當使用規格大于0.1ml/支裝量的鱟試劑時，為避免鱟試劑支間活性差異帶來的影響,應將堂試劑復溶后混合，再分裝到反應容器中使用。凝膠法常用的反應容器為10mmx75mm的玻璃小試管或空安瓿等，光度法常用的反應容器為測定儀專用試管或酶標板。在凝膠法檢驗時，如果計算出的MVD值不是整數，可以使用小于MVD的整數進行實驗。當出現陽性結果時，為判斷產品是否合格，需采用計算的MVD重新測試。

目前新的細菌內毒素檢測方法不斷出現,以適應特殊品種細菌內毒素檢査的需要,或減少鱟試劑的使用量。如重組C因子法(見附)、微量凝膠法等當采用細菌內毒素檢査法(通則1143)中未收載的方法檢測產品的細菌內毒素時,應符合”凡例”的相關規定。

附:重組C因子法

(因子是鱟試劑中對細菌內毒素敏感的蛋白,能夠選擇性識別內毒素。重組C因子是一種人工合成的C因子，它被細菌內毒素活化后,可與熒光底物作用產生與內毒素濃度成比例的熒光信號。

本法系依據反應混合物中的內毒素濃度和其孵育終止時的熒光值之間存在量化關系來測定細菌內毒素的含量，本法為終點熒光法。依據檢測原理，本法不存在G因子旁路干擾,具有較高的專屬性,因此適合于含有阝-葡聚糖干擾的樣品檢測;本法所用試劑不含有B因子和凝固酶原、凝固蛋白原等,因此，含有對上述物質抑制或增強作用的樣品適合使用重組C因子法。

重組C因子法試驗需采用熒光酶標儀,其激發和發射波長等參數參照試劑的使用說明書,激發/發射波長一般為380nm/440nm，檢測溫度一般為37°C+1'C。

儀器靈敏度(增益值)調節、重組C因子試劑的配制方法、保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。

標準曲線的可靠性試驗、干擾試驗、檢查法以及結果判斷 參照細菌內毒素檢育法(通則1143)中的方法2光度測定法。

來源：藥典委