一、概述

（一）前言

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，在疾病治療方面具有應用潛力。近年來，隨著干細胞技術的發展、認知的深入和經驗的積累，干細胞治療已逐步成為生物醫學領域的一大熱點。為規范和指導人源干細胞產品（以下簡稱干細胞產品）非臨床研究和評價，在《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》《基因修飾細胞治療產品非臨床研究技術指導原則（試行）》基礎上，根據目前對干細胞產品的科學認識，制定本指導原則，提出對干細胞產品非臨床研究和評價的特殊考慮和要求。隨著技術的發展、認知程度的深入和相關研究數據的積累，本指導原則將不斷完善和適時更新。

（二）適用范圍

本指導原則主要為按照藥品管理相關法規進行研發和注冊申報的人源干細胞產品的非臨床研究提供技術指導。本指導原則中的人源干細胞產品是指起源于人的成體干細胞（adult stem cells，ASCs）、人胚干細胞（embryonicstem cells，ESCs）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stemcells，iPSCs），經過一系列涉及干細胞的體外操作（一般包括擴增、基因修飾、誘導分化、轉分化等）獲得的干細胞及其衍生細胞產品。

二、總體考慮

（一）研究目的

非臨床研究是藥物開發的重要環節。干細胞產品的有效成分是具有一定生物學功能且具有不同程度分化潛力的細胞，與常規治療藥物相比，其治療機制、體內活性和毒性可能存在明顯差異，細胞與人體的相互作用也更具有種屬特異性，因此，與常規治療藥物相比，干細胞產品的非臨床研究具有其特殊性。干細胞產品非臨床研究的主要目的是：（1）對擬定的作用機制進行概念驗證，考察有效性潛力，明確其在擬定患者人群中使用的生物學合理性；（2）研究干細胞體內命運和行為；（3）根據潛在風險因素，闡明毒性反應特征，預測人體可能出現的不良反應，確定臨床監測指標，為制定臨床風險控制措施提供參考信息。應通過開展非臨床研究，收集用于獲益-風險評估的信息，以確定擬開發產品在目標患者人群中預期具有合理的、可接受的獲益-風險比，同時為臨床試驗的設計和風險控制策略的制定以及產品上市提供支持性依據。

（二）基本原則

1．具體情況

具體分析由于干細胞產品的物質組成和作用機制與小分子藥物、大分子生物藥物不同，所以傳統、標準的非臨床研究試驗方法可能不完全適用于干細胞產品。干細胞產品種類多、差異大、情況復雜、風險程度不同，因此，不同產品所需的非臨床研究內容和具體試驗設計應遵循“具體情況具體分析”的原則。

2．GLP 要求

干細胞產品的非臨床安全性研究一般應當在經過藥物非臨床研究質量管理規范（GLP）認證的機構開展，并遵守GLP。當某些特殊情況下無法遵守 GLP 時，例如采用非常規動物模型、在概念驗證或生物分布試驗中整合安全性檢測指標、檢測某些特殊指標等，應最大限度地按 GLP 原則進行試驗，確保試驗質量和數據的完整性及可追溯性。

3．隨機、對照、重復

試驗應遵循隨機、對照、重復的原則。

（三）制定非臨床研究策略時的重要關注點

1．非臨床研究考慮因素

干細胞具備自我更新和多向分化潛能，細胞類型多樣，細胞本身具備體內存續、增殖和/或分化、細胞間相互作用等能力。由于細胞本身生物學特性、制備工藝的復雜性、給藥方式的多樣性等因素，各類型干細胞產品的風險程度也可能不同。在非臨床研究中需要考慮以下因素（包括但不限于）：細胞來源、生物學特性、作用機制；生產過程（如體外培養、純化、誘導分化、擴增、基因修飾/改造等）；終產品中不同分化階段細胞的數量/比例；終產品中可能殘留的非目的細胞（如未分化細胞、非預期分化細胞等）、非細胞成分（如雜質、外源因子等）；臨床擬用人群、給藥方式、預期的藥理作用靶部位；細胞在受者體內的遷移、定植、分化、存續等；細胞的免疫原性和受者對細胞的免疫反應；成瘤性和致瘤性的風險等。此外，對于已有人體數據的干細胞產品，還可結合人體信息綜合評估預期的人體風險和獲益。涉及基因修飾的干細胞產品還需考慮以下因素（包括但不限于）：

（1）基因修飾的目的、方式、技術；

（2）基因轉導/編輯效率

（3）載體自身風險；

（4）基因修飾脫靶風險；

（5）基因修飾對細胞表型和生物學特性的影響；

（6）對于導入目的基因，還應考慮目的基因的表達情況和表達產物的生物學作用。

2．受試物

非臨床研究所用受試物應能代表臨床擬用樣品。體外、體內非臨床研究所使用的樣品均應符合相應開發階段的質量標準要求。若后續制備工藝發生變更，應闡明非臨床研究用樣品與臨床試驗擬用樣品的異同及其對人體有效性和安全性的可能影響，必要時開展變更前后樣品的非臨床橋接研究。當無法采用臨床擬用產品進行動物試驗而采用動物源替代產品開展試驗時，動物源替代產品應與臨床擬用產品采用相似的生產工藝，并對可能影響有效性和安全性的關鍵質量參數進行對比研究，以評估替代產品與臨床擬用產品的相似性及其對非臨床數據預測性的影響。目前，對于不同種屬來源的干細胞之間的相似性的研究尚不充分，尚缺乏統一的相似性評價標準。因此，采用從動物源替代產品非臨床試驗中獲得的數據進行臨床轉化時，存在一定的不確定性。

3．動物種屬/模型選擇

應盡可能選擇相關動物種屬/模型進行非臨床體內研究。動物種屬/模型的選擇應該具有科學合理的依據。選擇相關動物時需要考慮產品特性和臨床擬用情況，包括但不限于以下因素：

（1）動物對人源干細胞及其分化后細胞的生物學反應與預期的人體反應的相似性；

（2）動物對人源干細胞的免疫耐受性；

（3）動物的解剖學和病理生理學特征與擬定適應癥人群的相似性；

（4）臨床擬用給藥途徑/給藥方式的可行性；

（5）涉及基因修飾的干細胞產品，還應考慮動物對目的基因或基因表達產物的敏感性、表達產物在動物體內的生物學效應。

采用疾病動物模型開展的研究可以同時提供干細胞產品的藥理活性和毒性信息，也可以模擬臨床患者的病理生理狀態，因此，必要時可考慮采用疾病動物模型進行非臨床研究。免疫功能正常的動物給予人源干細胞后，可能出現免疫應答反應，導致細胞被過早或快速清除，此種情況下，可考慮采用免疫缺陷或免疫系統人源化的動物模型開展非臨床研究。免疫缺陷動物包括遺傳性免疫缺陷動物模型、經免疫抑制劑/物理照射方法構建的免疫抑制動物模型等，可根據情況進行合理選擇。需要關注的是，每種動物種屬/模型均有其優點和不足，沒有一種動物種屬/模型可全面預測干細胞產品在患者人群中的有效性和安全性。因此，在選擇動物種屬/模型時，應評估所采用的動物種屬/模型與人體的相關性和局限性。若有多種相關動物種屬/模型，且這些動物種屬/模型可提供互補的證據，建議采用多種動物種屬/模型開展研究。當缺少相關動物種屬/模型時，基于細胞和組織的模型（如二維或三維組織模型、類器官和微流體模型等）可能為非臨床有效性和安全性的評估提供有用的補充信息。同源動物模型（即在同一動物種屬中使用動物源替代產品來模擬人類細胞產品的動物模型）可能可以為概念驗證提供支持性信息，在無法采用臨床擬用產品進行動物試驗（應提供依據）的情況下可以考慮采用。然而，由于動物干細胞和人類干細胞之間的差異性，從該模型獲得的研究數據在預測人體反應方面存在不確定性，因此對該動物模型中獲得的數據應進行謹慎分析。

4．給藥方式/途徑

非臨床研究中的給藥方式/途徑應能最大程度模擬臨床擬用給藥方式/途徑。如果在動物試驗中采用其他的給藥方式/途徑，應闡明其科學性和合理性依據。某些情況下，干細胞產品可能涉及干細胞產品以外的其他材料（如生物材料、細胞支架、特殊給藥設備等）的應用，也可能與其他醫學干預措施聯合使用（如手術、組織提取操作、免疫抑制），這些材料或干預措施可能會與干細胞產品相互作用，且這些材料或干預措施之間也可能發生相互作用。此種情況下，非臨床研究應盡可能模擬臨床給藥方案。

5．整合試驗

基于干細胞產品特點、相關動物種屬/模型的可獲得性，某些非臨床試驗可整合在其他試驗中進行。例如，如果可行且科學合理，在疾病動物模型的藥效學試驗中伴隨考察毒理學指標，將藥代動力學試驗整合至藥效學試驗和/或毒理學試驗中。整合試驗設計有助于闡明藥代動力學、藥效、毒性的相關性。

三、基本內容

（一）藥理學研究/概念驗證

應通過藥理學試驗闡述干細胞產品的可能作用機制以及在擬定患者人群中使用的生物學合理性。試驗設計應考慮干細胞產品的作用機制、給藥方式、產品特性和存續時間等因素。干細胞產品的藥理學研究通常包括體外和體內試驗。體外試驗應對細胞的表型和功能特性進行研究，如細胞增殖能力、分化潛力、分泌能力以及其他生理功能活性等。若涉及基因修飾或其他改造，還應研究這些修飾或改造對細胞生理、行為和功能活性的潛在影響。體內試驗應盡可能在與人類疾病相關的疾病動物模型中驗證細胞產品可發揮預期的藥理學作用。疾病動物模型和主要終點的選擇應結合細胞的藥理學作用機制和擬用的患者人群綜合考慮。對于涉及組織再生/修復的產品，應關注對長期效應的評估。體外和體內試驗應足以全面驗證產品的設計理念。

（二）藥代動力學研究

干細胞產品的藥代動力學研究信息對提示其有效性和安全性至關重要。應參考《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》中對細胞治療產品藥代動力學的一般要求，采用相關動物種屬開展藥代動力學試驗，以闡明干細胞產品在體內的命運和行為。根據產品特性，檢測與藥效和毒性相關的藥代動力學行為，如生物分布、遷移、定植、增殖、分化、存續性等。疾病動物模型可能對評估干細胞產品的分布特征更有意義，鼓勵在藥效學試驗中伴隨生物分布研究。生物分布試驗設計時應考慮到干細胞的體內命運是一個多步驟過程，應動態觀察干細胞的生物分布特征，可采用的技術方法有影像技術、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、免疫組化技術、原位雜交技術等，試驗設計需要考慮技術方法的適用性和優缺點。涉及基因修飾的干細胞產品還應參考 ICH S12 指導原則對目的基因的存續、表達（部位、水平、持久性）以及表達產物的生物學活性進行必要的研究。

（三）非臨床安全性研究

在制定非臨床安全性研究策略時，除參考《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》中對細胞治療產品的一般要求外，還應根據每個產品的特點，按照基于風險的原則具體問題具體分析，除參考本指導原則“二、總體考慮”項下“1.非臨床研究考慮因素”小節內容外，還應考慮的因素包括已有的非臨床/臨床數據、類似產品的有效性和安全性信息等。

1．安全藥理學

干細胞及其分化的功能細胞和/或其分泌的活性物質、處方中非細胞成分等可能會對中樞神經系統、心血管系統、呼吸系統等產生影響。在首次臨床試驗前，應結合細胞產品的特性、細胞在體內的分布特征評估其對中樞神經系統、心血管系統、呼吸系統的潛在影響。經評估存在安全性擔憂時，應考慮進行安全藥理學試驗，若無法進行，應說明理由。這些試驗可結合在一般毒理學試驗中，若結合進行，需按安全藥理學試驗的要求進行設計。在必要時，可能需要開展補充和追加的安全藥理學研究。

2．一般毒理學

一般毒理學試驗主要用于評價干細胞產品的全身毒性和局部毒性、急性毒性和長期毒性或延遲毒性、劑量和效應關系等。應基于干細胞產品的生物學特性、可能的風險因素和安全性擔憂，采用基于風險、科學導向的靈活設計方案。

2.1 動物種屬選擇

關于毒理學試驗動物種屬的選擇，應基于干細胞產品的風險大小、相關動物種屬/模型的可獲得性等因素綜合分析，總體目標是盡可能最大程度地闡明干細胞產品的安全性特征，為人體安全性提供有價值的預測信息。在可行的情況下，盡量考慮獲得兩種相關動物種屬的非臨床安全性信息；若不可行，需提供不可行的科學合理的依據。在某些情況下，基于品種的特點和對同類品種已有的安全性認識，一種動物種屬的毒理學試驗可能也是能接受的，但是應提供科學合理性依據。動物種屬選擇的考慮因素參考本指導原則“二、總體考慮”項下“3.動物種屬/模型選擇”的建議。通常在一般毒性試驗開展前，應探索與人體相關的潛在動物種屬/模型，基于充分的科學合理的信息，來支持動物種屬的選擇。通常采用雌雄兩種性別動物進行試驗。若采用單性別進行試驗，應提供合理性依據。

2.2 分組和劑量設計

通常情況下，一般毒理學試驗中的給藥劑量應包括多個劑量。合適的劑量間距，有助于評估毒性反應-劑量關系的陡峭程度和 I 期臨床劑量遞增方案的設計。高劑量一般期望獲得明顯毒性反應的相關信息，通常為藥效學最高劑量的一定倍數或擬推薦臨床最高劑量的一定倍數。最高劑量的設置可能會受到動物模型、給藥部位容量/大小、給藥途徑和制劑最高濃度等限制，可選擇最大可行劑量作為最高劑量。需結合處方組成和生產工藝，設置合適的對照組，以幫助確定試驗中發現的不良結果是否與受試物相關。

2.3 給藥方案

試驗中的給藥方案應最大程度地模擬臨床擬用給藥方案，給藥途徑、給藥頻率和試驗期限應能反映臨床使用情況。結合產品的預期存續特點和在動物中的藥代動力學特征設置合適的給藥次數、給藥頻率和試驗期限，并確保試驗中動物暴露于受試物和/或表達產物。

2.4 檢測指標

對于在體內可能長期存續發揮作用的產品，建議一般毒理學試驗中設置多個剖檢時間點，以評估可能的急性期反應和長期存續導致的長期毒性或延遲毒性。除常規觀察指標外，還需結合產品特點和風險，選擇合適的檢測指標。對于系統給藥的干細胞產品，應關注異位組織形成的風險。當形成異位組織時，應考慮其類型和發生率、解剖位置和起源。必要時應采用免疫組化等方法對異位組織的細胞來源進行分析評估。

3．成瘤性和致瘤性

干細胞產品、干細胞產品中殘留的未分化細胞或轉化細胞可能會存在致癌性風險，致癌性是干細胞產品安全性評價的重點關注內容，但是標準的嚙齒類動物致癌性試驗不適用于干細胞產品，需采用成瘤性和致瘤性試驗評估干細胞產品的致癌性潛力。成瘤性和致瘤性試驗應采用臨床擬用產品進行試驗，不可采用動物源替代產品。

3.1 成瘤性（Tumorigenicity）風險

干細胞產品的成瘤性系指動物接種細胞后由接種細胞本身形成腫瘤的可能性，即接種的細胞自身形成腫瘤的可能性。干細胞產品的成瘤性風險來源包括但不限于：終產品、終產品中殘留的未分化細胞、終產品中其它未知的未分化完全細胞具有較高的增殖和分化能力，在體內可能具有形成腫瘤的風險；基因修飾、長時間體外培養等操作可能導致細胞的基因、表觀遺傳學改變，使細胞可能具有轉化為腫瘤細胞的風險。干細胞產品的成瘤性風險大小取決于細胞的來源、表型、分化狀態、增殖能力、體外培養條件、體外處理方式/程度、注射部位和注射途徑等。多能干細胞（如 iPSCs 和 ESCs）與成體干細胞[如間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)]在腫瘤形成的固有風險方面存在明顯差異。正常的成體干細胞通常沒有固有的成瘤性，但如果在體外培養過程中發生轉化，它們在體內也有可能形成腫瘤。多能干細胞具有形成畸胎瘤的固有特征，當在敏感解剖部位（例如中樞神經系統）形成畸胎瘤時，會引起安全性擔憂。未分化的多能干細胞也可能產生惡性畸胎瘤。

3.2 致瘤性（Oncogenicity）風險

干細胞產品的致瘤性系指終產品通過臨床擬用途徑給予受者（受試者/患者）后，導致受者形成腫瘤的可能性，即終產品促使正常細胞轉變為腫瘤細胞的可能性。

3.3 成瘤性和致瘤性非臨床研究策略

在開展首次臨床試驗前，應基于干細胞產品的生物學特性（細胞成瘤的可能性）、體外處理方式/程度（培養傳代次數、基因修飾等）、細胞存續特點、臨床擬用給藥途徑等因素，評估干細胞產品的成瘤性和/或致瘤性風險。目前評價干細胞產品成瘤性的體外試驗包括但不限于：核型分析（用于評估遺傳穩定性）、軟瓊脂克隆形成試驗（用于檢測轉化細胞）、端粒酶活性檢測（用于評估端粒酶活性水平）、數字 PCR（用于檢測未分化的 iPSCs 或 ESCs）等。可根據產品特點選擇合適的體外試驗方法。動物成瘤性和致瘤性試驗是干細胞產品致癌性潛力評估的重要內容，但是應認識到其在相關動物模型選擇及臨床預測價值方面尚存在局限性。設計體內成瘤性和致瘤性試驗時，干細胞產品應能在所選擇的動物模型中存活足夠長的時間以評價腫瘤形成的潛力，因此試驗中需伴隨評估植入細胞的存續情況。試驗應設計合適的對照（如未分化細胞、部分分化細胞或陽性對照、溶媒對照等）以確立實驗系統的敏感性和可靠性；設置合適的動物數量，使得足以對結果進行科學分析；應包含一個最大可行劑量；應至少包含臨床擬用給藥途徑，以確保可將細胞產品遞送到臨床擬用靶部位（除下文所述在有合理依據時體內成瘤性試驗可采用敏感給藥途徑外）；試驗期限應足以觀察到腫瘤形成。（注釋 1）對于成瘤性和致瘤性風險較低的成體干細胞產品，通常應在首次臨床試驗前至少完成體外成瘤性評價；對于擬用于非晚期腫瘤適應癥且風險較低的干細胞產品，通常在上市前完成體內成瘤性和/或致瘤性試驗。對于成瘤性和/或致瘤性風險較高的干細胞產品（例如多能干細胞產品、其他分化程度較低的干細胞產品、藥學和/或已有非臨床研究提示風險較高的產品等），在首次臨床試驗前，應完成體外成瘤性評價、臨床給藥途徑或敏感給藥途徑（如皮下注射、睪丸注射、肌腱注射、脊髓內注射等，應有合理依據）的體內成瘤性試驗；若成瘤性試驗出現陽性結果，或者一般毒理學試驗中發現受者來源的癌前病變、可疑癌變等，首次臨床試驗前還應完成臨床給藥途徑的致瘤性試驗。若成瘤性試驗結果為陰性，上市前完成臨床給藥途徑的致瘤性試驗。

當在動物成瘤性和/或致瘤性試驗中觀察到腫瘤發生時，需進行腫瘤細胞的種屬來源分析，以明確其來自于接種的干細胞產品還是來自于受者，分析屬于成瘤性還是致瘤性。考慮到非臨床評價方法在預測干細胞產品成瘤性和致瘤性風險方面的局限性，需在臨床試驗中對受試者進行長期隨訪，關注腫瘤形成風險。對于擬用于腫瘤患者的人源干細胞產品，建議結合產品特性評估促進腫瘤進展的風險，必要時開展促瘤性試驗。

4．免疫毒性和免疫原性

干細胞產品需關注其誘導產生的免疫毒性，需采用合適的方法開展免疫毒性研究。在非臨床研究階段，可根據產品的特性和風險評估考慮是否開展干細胞產品的免疫原性研究。對于涉及基因修飾的干細胞產品，其表達的蛋白質與天然產物相比結構可能發生改變，或基因修飾可能產生非預期的肽/蛋白質等，需評價免疫原性。可開展免疫原性發生機制/影響因素相關的體外研究，尤其當體內免疫原性研究無法開展時（注釋 2）。

5．遺傳毒性

干細胞產品通常不需要進行標準組合的遺傳毒性試驗。如果終產品中的非細胞成分與 DNA 或其他遺傳物質存在直接的相互作用，需評估其遺傳毒性風險，必要時開展試驗。對于涉及基因修飾的干細胞產品，需參考《基因修飾細胞治療產品非臨床研究技術指導原則（試行）》進行基因插入突變、基因編輯脫靶等風險評估。

6．生殖毒性

干細胞產品應根據產品的特性、作用機制、臨床適應癥和臨床擬用人群、一般毒理學試驗中的發現、生物分布特征等信息評估潛在的生殖和發育毒性風險。干細胞產品生殖毒性試驗的研究策略和風險評估可參考相關指導原則。

7．制劑安全性

應根據干細胞產品的特點與臨床應用情況考慮開展終產品制劑的刺激性、溶血性試驗。

8．其他

目前，干細胞產品的細胞來源、生產工藝、適應癥定位、臨床應用情況等方面存在較大的多樣性，必要時，應基于產品特點及風險考慮開展或追加其他試驗。

四、注釋

注釋 1：對于干細胞產品的成瘤性和致瘤性試驗，目前尚無國際公認的試驗方法，尚需不斷積累經驗。但是，成瘤性和致瘤性試驗的目的是為了提示干細胞產品的致癌性潛力，試驗設計應達到能夠敏感地檢測到潛在的成瘤性和致瘤性的目標。關于成瘤性、致瘤性試驗的試驗期限，基于試驗目的、動物模型壽命、不同給藥途徑下腫瘤發生的敏感程度等因素考慮，基于現有的認知，建議靜脈給藥途徑的成瘤性和致瘤性試驗的觀察期限不短于 6 個月，若采用敏感的其他給藥途徑進行成瘤性試驗，建議觀察期限不短于 4 個月；但在可行的情況下延長觀察期限可能更有利于成瘤性和致瘤性評價。

注釋 2：非臨床免疫原性研究通常指體內研究，如采用免疫功能正常的動物給予干細胞產品后檢測免疫原性，通常可伴隨在一般毒理學試驗中開展。針對干細胞產品，有文獻報道與免疫原性發生機制/影響因素有關的體外研究方法，例如檢測干細胞表面的 MHCⅠ類和 MCHⅡ類分子、共刺激分子的表達情況，混合淋巴細胞共培養試驗等，這些試驗對預測和評估人體免疫原性風險也有一定參考價值。但是，這些方法尚處于研究中，尚未形成公認的方法，需繼續積累經驗。

五、參考文獻

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來源：CDE

原文下載：人源干細胞產品非臨床研究技術指導原則.pdf