一、概述

重組腺相關(guān)病毒（ Recombinant adeno-associatedvirus，rAAV）載體因理化性質(zhì)穩(wěn)定，致病性、整合風(fēng)險(xiǎn)低，外源基因表達(dá)持久等特點(diǎn)，成為基因治療領(lǐng)域內(nèi)重要的病毒載體之一。rAAV 產(chǎn)品創(chuàng)新程度較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜多樣，質(zhì)量研究和控制方法發(fā)展迅速，監(jiān)管和業(yè)界對 rAAV 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝和質(zhì)量研究等方面的認(rèn)知仍處于不斷探索和完善中。本文根據(jù)現(xiàn)階段的科學(xué)認(rèn)知、行業(yè)實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)積累，對不同生產(chǎn)工藝的外源病毒因子風(fēng)險(xiǎn)控制策略、質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定過程中的共性問題提出一般性技術(shù)要求，以供申請人/持有人參考。本文件僅反映監(jiān)管部門當(dāng)前對 rAAV 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝和質(zhì)量研究相關(guān)共性問題的一般要求，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和監(jiān)管經(jīng)驗(yàn)的積累，相關(guān)內(nèi)容將不斷完善與更新。

二、常見問題與技術(shù)要求

（一）外源病毒因子風(fēng)險(xiǎn)控制的一般要求

目前 rAAV 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝類型多樣，不同類型生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品，可能引入的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)程度不同，因而外源病毒因子控制策略有所不同。因此，建議深入分析不同生產(chǎn)工藝病毒污染的潛在來源，并根據(jù)工藝特點(diǎn)、產(chǎn)品特點(diǎn)采用多階段控制策略以控制整體風(fēng)險(xiǎn)。

1、情形一：采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系生產(chǎn)的rAAV 產(chǎn)品采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品，病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)可能來自細(xì)胞系（即生產(chǎn)用細(xì)胞），生產(chǎn)過程中使用的動(dòng)物/人源生產(chǎn)用原材料，也可能來自生產(chǎn)過程中的偶然引入。因此，該情形下的 rAAV 產(chǎn)品外源病毒因子風(fēng)險(xiǎn)控制策略建議如下：

（1）細(xì)胞庫方面，建議按照 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關(guān)技術(shù)指南要求對主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫、生產(chǎn)終末細(xì)胞或生產(chǎn)限定代次細(xì)胞進(jìn)行檢定，結(jié)合細(xì)胞來源、傳代或改造歷史、建庫過程中使用的原材料情況等進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估后確定外源病毒因子檢測種類。

（2）動(dòng)物/人源生產(chǎn)用原材料方面，應(yīng)結(jié)合其來源、生產(chǎn)工藝等開展特異性外源病毒因子檢測，外源病毒因子檢測種類應(yīng)全面，檢測方法應(yīng)足夠靈敏。

（3）生產(chǎn)工藝控制方面，建議選擇適宜的生產(chǎn)步驟進(jìn)行工藝過程中外源病毒因子的風(fēng)險(xiǎn)控制，并設(shè)立合理的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。通常選擇未加工收獲液作為檢測樣品，具體檢測方法可參考 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關(guān)技術(shù)指南的要求。

（4）病毒清除驗(yàn)證方面，根據(jù)上述（1）-（3）檢測結(jié)果，如果在細(xì)胞庫檢定和未加工收獲液中未發(fā)現(xiàn)除 rAAV 以外的其他病毒、病毒樣顆粒（Virus-like particles, VLP）或逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒（Retrovirus-like particle, RVLP），則建議使用非特異“模型”病毒開展病毒去除/滅活驗(yàn)證，評估現(xiàn)有生產(chǎn)工藝步驟對非特異“模型”病毒的清除能力。同時(shí)，如果在細(xì)胞庫檢定和未加工收獲液中未檢出 RVLP，且PERT 檢測結(jié)果為陰性，則不需要進(jìn)一步評估每個(gè)劑量中逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒量。反之，如果在細(xì)胞庫檢定和未加工收獲液中發(fā)現(xiàn)除 rAAV 以外的其他病毒、VLP 或 RVLP，病毒清除驗(yàn)證研究建議使用已鑒定的病毒，如果不能使用已鑒定的病毒，則應(yīng)使用“相關(guān)”病毒或特異“模型”病毒開展研究。同時(shí)，還應(yīng)考慮使用對物理或化學(xué)方法處理具有顯著耐受性的非特異“模型”病毒進(jìn)行驗(yàn)證。

（5）原液/純化后產(chǎn)品外源病毒因子檢測方面，根據(jù)上述（1）-（4）檢測結(jié)果和風(fēng)險(xiǎn)評估,如認(rèn)為外源病毒因子污染風(fēng)險(xiǎn)可控，則不需要開展原液/純化后產(chǎn)品的外源病毒因子檢測。

2、情形二：采用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品采用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品，病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)可能來自包裝/生產(chǎn)用細(xì)胞以及病毒種子批，生產(chǎn)過程中使用的動(dòng)物/人源生產(chǎn)用原材料，也可能來自生產(chǎn)過程中的偶然引入。因此，該情形下的 rAAV 產(chǎn)品外源病毒因子風(fēng)險(xiǎn)控制策略建議如下：

（1）包裝/生產(chǎn)用細(xì)胞、動(dòng)物/人源生產(chǎn)用原材料方面，控制要求參見情形一 “（1）-（2）”所述。

（2）病毒種子批方面，檢定應(yīng)符合 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關(guān)技術(shù)指南的要求，并根據(jù)病毒種子批建立的特定情況，以及對病毒種子相關(guān)特征的評估，設(shè)定相應(yīng)的檢定項(xiàng)目，并選擇合適的檢測方法。

（3）生產(chǎn)工藝控制方面，建議選擇適宜的生產(chǎn)步驟進(jìn)行工藝過程中外源病毒因子的風(fēng)險(xiǎn)控制，并設(shè)立合理的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。通常選擇未加工收獲液作為檢測樣品，具體檢測方法可參考 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關(guān)技術(shù)指南的要求。同時(shí)，應(yīng)在上市階段提供至少 3 批次商業(yè)化代表性工藝的未加工收獲液的桿狀病毒和彈狀病毒定量檢測結(jié)果，用于評估整體生產(chǎn)工藝對外源病毒因子的清除效果。

（4）病毒清除驗(yàn)證方面，由于包裝/生產(chǎn)用細(xì)胞中可能含有彈狀病毒，并且生產(chǎn)體系中引入了重組桿狀病毒，因此，應(yīng)考慮在生產(chǎn)工藝中設(shè)立病毒去除/滅活單元，并參考 ICHQ5A（R2）的一般原則開展病毒去除/滅活驗(yàn)證研究。原則上，病毒清除驗(yàn)證研究應(yīng)使用已鑒定的病毒，如果不能使用已鑒定的病毒，則應(yīng)使用“相關(guān)”病毒或特異“模型”病毒開展研究，如桿狀病毒和水泡性口炎病毒（可代表 sf9 細(xì)胞系中內(nèi)源性彈狀病毒）。同時(shí)，還應(yīng)考慮使用對物理或化學(xué)方法處理具有顯著耐受性的非特異“模型”病毒進(jìn)行驗(yàn)證。選擇模型病毒的種類和數(shù)量應(yīng)根據(jù)包裝/生產(chǎn)用細(xì)胞質(zhì)量和特性，以及生產(chǎn)工藝綜合考慮，一般建議使用至少 3 種不同特性的病毒對工藝的病毒清除能力進(jìn)行評估。建議評價(jià)特定的工藝步驟對特異或非特異“模型”病毒的去除/滅活效果，并評估整體生產(chǎn)工藝步驟對特異“模型”病毒的總體清除效果。常見的病毒去除/滅活步驟通常包括溶劑/去污劑處理、低 pH 孵育、柱層析、納濾等，建議基于風(fēng)險(xiǎn)評估考慮采用多種不同原理的病毒去除/滅活工藝步驟。

（5）原液/純化后產(chǎn)品外源病毒因子檢測方面，根據(jù)上述情形二“（1）-（3）”檢測和控制，以及情形二“（4）”對“相關(guān)”病毒或特異“模型”病毒的清除能力和效果，開展充分的風(fēng)險(xiǎn)評估，如認(rèn)為外源病毒因子污染風(fēng)險(xiǎn)可控，則建議上市申請時(shí)，提供至少 3 批次商業(yè)化代表性工藝的原液/純化后產(chǎn)品的殘留重組桿狀病毒和彈狀病毒檢測結(jié)果，檢測方法應(yīng)選擇特異性和靈敏度較高的合適方法,并進(jìn)行充分的方法學(xué)驗(yàn)證。在沒有充分的證據(jù)證明生產(chǎn)工藝對“相關(guān)”病毒或特異“模型”病毒具有穩(wěn)健的清除能力和效果的情況下，應(yīng)對每個(gè)批次原液/純化后產(chǎn)品進(jìn)行桿狀病毒和彈狀病毒殘留的檢測。

3、情形三：采用腺病毒、單純皰疹病毒等輔助病毒生產(chǎn)的rAAV 產(chǎn)品采用腺病毒、單純皰疹病毒等輔助病毒生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品，病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)可能來自包裝/生產(chǎn)用細(xì)胞以及病毒種子批，生產(chǎn)過程中使用的動(dòng)物/人源生產(chǎn)用原材料，也可能來自生產(chǎn)過程中的偶然引入。因此，該情形下的 rAAV 產(chǎn)品外源病毒因子風(fēng)險(xiǎn)控制策略建議如下：

（1）包裝/生產(chǎn)用細(xì)胞、動(dòng)物/人源生產(chǎn)用原材料方面，控制要求參見情形一 “（1）-（2）”所述。

（2）病毒種子批檢定方面，控制要求參見情形二“（2）”所述。

（3）生產(chǎn)工藝控制方面，建議選擇適宜的生產(chǎn)步驟進(jìn)行工藝過程中外源病毒因子的風(fēng)險(xiǎn)控制，并設(shè)立合理的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。通常選擇未加工收獲液作為檢測樣品，具體檢測方法可參考 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關(guān)技術(shù)指南的要求。同時(shí)，應(yīng)在上市階段提供至少 3 批次商業(yè)化代表性工藝的未加工收獲液的輔助病毒定量檢測結(jié)果，用于評估整體生產(chǎn)工藝對外源病毒因子的清除效果。

（4）病毒清除驗(yàn)證方面，由于生產(chǎn)過程中使用了輔助病毒，因此，應(yīng)考慮在生產(chǎn)工藝中設(shè)立病毒去除/滅活單元，并參考 ICH Q5A（R2）的一般原則開展病毒去除/滅活驗(yàn)證研究。原則上，病毒清除驗(yàn)證研究應(yīng)使用已鑒定的病毒，如果不能使用已鑒定的病毒，則應(yīng)使用“相關(guān)”病毒或特異“模型”病毒開展研究，如腺病毒、皰疹病毒等。同時(shí)，還應(yīng)考慮使用對物理或化學(xué)方法處理具有顯著耐受性的非特異“模型”病毒進(jìn)行驗(yàn)證。選擇模型病毒的種類和數(shù)量應(yīng)根據(jù)包裝/生產(chǎn)用細(xì)胞質(zhì)量和特性，以及生產(chǎn)工藝綜合考慮，一般建議使用至少 3 種不同特性的病毒對工藝的病毒清除能力進(jìn)行評估。建議評價(jià)特定的工藝步驟對特異性或非特異“模型”病毒的去除/滅活效果，并評估整體生產(chǎn)工藝步驟對特異“模型”病毒的總體清除效果。常見的病毒去除/滅活步驟通常包括溶劑/去污劑處理、低 pH 孵育、柱層析、納濾等，建議基于風(fēng)險(xiǎn)評估考慮采用多種不同原理的病毒去除/滅活工藝步驟。

（5）原液/純化后產(chǎn)品外源病毒因子檢測方面，根據(jù)上述情形三“（1）-（3）”全面檢測和控制，以及情形三“（4）”對“相關(guān)”病毒或特異“模型”病毒的清除能力和效果，開展充分的風(fēng)險(xiǎn)評估，如認(rèn)為外源病毒因子污染風(fēng)險(xiǎn)可控，則建議上市申請時(shí)，提供至少 3 批次商業(yè)化代表性工藝的原液/純化后產(chǎn)品的殘留輔助病毒檢測結(jié)果，檢測方法應(yīng)選擇特異性和靈敏度高的合適方法,并進(jìn)行充分的方法學(xué)驗(yàn)證。在沒有充分的證據(jù)證明生產(chǎn)工藝對“相關(guān)”病毒或特異“模型”病毒具有穩(wěn)健的清除能力和效果的情況下，應(yīng)對每個(gè)批次的原液/純化后產(chǎn)品進(jìn)行殘留輔助病毒的檢測。

（二）純度檢測方法選擇和標(biāo)準(zhǔn)限度制定的一般要求

1.rAAV 產(chǎn)品純度檢測方法選擇的一般要求CE-SDS 方法和 SDS-PAGE 方法均可用于 rAAV 產(chǎn)品的純度控制，以上方法是基于在變性條件下蛋白與 SDS 結(jié)合形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物，這些復(fù)合物在電場作用下根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，是目前蛋白質(zhì)純度檢測比較常見的方法。

其中，CE-SDS 方法在分離度、精密度、耐用性等方面優(yōu)于 SDSPAGE 方法。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，新的更優(yōu)的檢測方法也可能逐步應(yīng)用，因此，鼓勵(lì)優(yōu)先采用精密度和準(zhǔn)確度較高的檢測方法用于產(chǎn)品純度檢測。臨床試驗(yàn)推進(jìn)過程中，純度檢測方法可能隨著檢測技術(shù)的發(fā)展發(fā)生變更。如在臨床期間發(fā)生純度檢測方法的變更，建議盡可能在早期臨床試驗(yàn)階段進(jìn)行方法變更，同時(shí)根據(jù)方法變更情況評估風(fēng)險(xiǎn)，開展必要的變更后方法的確認(rèn)或驗(yàn)證，并開展變更前后方法的橋接對比研究，應(yīng)確保變更后方法對產(chǎn)品質(zhì)量的控制能力與變更前方法相當(dāng)或更優(yōu)。變更前后方法檢測結(jié)果存在差異時(shí)，建議盡可能采用變更后方法對既往臨床試驗(yàn)用代表性批次及穩(wěn)定性研究代表性批次進(jìn)行重新檢測，積累批次數(shù)據(jù)，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

2.rAAV 產(chǎn)品單體和聚集體含量質(zhì)量控制的一般要求rAAV 產(chǎn)品單體和聚集體含量可反映生產(chǎn)工藝的穩(wěn)健性和產(chǎn)品質(zhì)量特性，因此，建議開展 rAAV 產(chǎn)品單體和聚集體的質(zhì)量研究，并納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。目前用于檢測 rAAV 產(chǎn)品單體和聚集體的方法較多，比如 SEC-HPLC/MALS、AUC、DLS 等，各種方法具有各自不同的特點(diǎn)，考慮到早期研發(fā)階段對產(chǎn)品的認(rèn)知尚淺，建議盡可能采用多種技術(shù)手段或方法對產(chǎn)品單體和聚集體開展全面的表征研究。臨床試驗(yàn)階段建議監(jiān)測各批次單體和聚集體的數(shù)據(jù)，以及穩(wěn)定性期間數(shù)據(jù)的變化情況，以合理擬定單體和聚集體的標(biāo)準(zhǔn)限度。

3.rAAV 產(chǎn)品特征性衣殼蛋白（VP1、VP2、VP3）控制策略的一般要求rAAV 產(chǎn)品中，VP1、VP2、VP3 含量差異較大，通常 VP1和 VP2 含量較低，VP3 含量較高，其中某些血清型的 rAAV 產(chǎn)品含有部分 VP3 分子變體，因此，建議結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)、分子設(shè)計(jì)、受工藝影響的程度以及對安全性、有效性、質(zhì)量可控性的影響程度等，綜合考慮制定特征性衣殼蛋白（VP1、VP2、VP3）以及 VP3 分子變體的控制策略。必要時(shí)，除了對 rAAV產(chǎn)品 VP1+VP2+VP3 總量進(jìn)行控制外，還應(yīng)結(jié)合 VP3 變體對病毒結(jié)構(gòu)或功能影響的風(fēng)險(xiǎn)評估，對 VP3 分子變體含量進(jìn)行單獨(dú)控制。

（三）基因組滴度檢測方法選擇和不同方法橋接對比研究的一般要求

1.rAAV 產(chǎn)品基因組滴度檢測方法選擇的一般要求

目前 rAAV 產(chǎn)品基因組滴度檢測方法常見 qPCR 和d(d)PCR 方法，其中，d(d)PCR 方法相比 qPCR 方法是對基因拷貝數(shù)的絕對定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，新的更優(yōu)的檢測方法也可能逐步應(yīng)用，因此，鼓勵(lì)優(yōu)先采用精密度和準(zhǔn)確度較高的檢測方法用于產(chǎn)品基因組滴度檢測。

2.不同的基因組滴度檢測方法橋接對比研究的一般要求臨床試驗(yàn)推進(jìn)過程中，基因組滴度檢測方法可能隨著檢測技術(shù)的發(fā)展隨之發(fā)生變更。鑒于基因組滴度對于確保產(chǎn)品劑量準(zhǔn)確性及安全性至關(guān)重要，如發(fā)生方法學(xué)變更，建議盡可能在早期臨床試驗(yàn)階段進(jìn)行方法變更，同時(shí)根據(jù)方法變更情況綜合評估風(fēng)險(xiǎn)，開展必要的變更后方法的確認(rèn)或驗(yàn)證，并對變更前后方法進(jìn)行橋接研究，應(yīng)確保變更后方法對產(chǎn)品質(zhì)量的控制能力與變更前方法相當(dāng)或更優(yōu)，以確保臨床使用劑量的準(zhǔn)確性。

以目前常見的兩種基因組滴度檢測方法為例，由于 qPCR方法和 d(d)PCR 方法在檢測原理、引物設(shè)計(jì)等方面存在差異，不同檢測方法的檢測結(jié)果可能存在差異，建議盡可能采用變更后方法對既往臨床試驗(yàn)用代表性批次及穩(wěn)定性研究代表性批次進(jìn)行重新檢測，積累批次數(shù)據(jù)，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

（四）空殼率檢測方法選擇和標(biāo)準(zhǔn)限度制定的一般要求

1.rAAV 產(chǎn)品空殼率檢測方法的一般要求

目前 rAAV 產(chǎn)品常見的空殼率檢測方法包括 AUC 方法、IE-HPLC 方法、SEC-MALS 方法等。IE-HPLC 方法和 SEC-MALS方法平臺(tái)成熟，分析速度快，通量高，但可能無法完全區(qū)分部分包裝病毒和完整包裝病毒。相比 IE-HPLC、SEC-MALS 方法，AUC 法對完整包裝病毒、部分包裝病毒和空殼病毒的分離效果較好，實(shí)測空殼率與理論空殼率差異較小，目前也被行業(yè)廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，新的更優(yōu)的檢測方法也可能逐步應(yīng)用，因此，鼓勵(lì)優(yōu)先采用精密度和準(zhǔn)確度較高的檢測方法用于空殼率檢測和控制。

2.rAAV 產(chǎn)品空殼率標(biāo)準(zhǔn)限度制定的一般要求

建議基于產(chǎn)品特點(diǎn)、生產(chǎn)工藝和既往歷史批次檢測數(shù)據(jù)、給藥方式和劑量，以及與臨床安全性和有效性的相關(guān)性等因素綜合考慮制定空殼率標(biāo)準(zhǔn)限度。應(yīng)特別關(guān)注，如果空殼率檢測方法發(fā)生變更，應(yīng)評估變更對檢測結(jié)果的影響，開展變更前后檢測方法的橋接對比研究，以合理擬定空殼率標(biāo)準(zhǔn)限度。

（五）效價(jià)檢測方法選擇的一般要求

效價(jià)是反映產(chǎn)品生物學(xué)活性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。鼓勵(lì)早期臨床試驗(yàn)階段，根據(jù)產(chǎn)品設(shè)計(jì)和對產(chǎn)品作用機(jī)制的理解，初步建立生物學(xué)活性分析方法，并對各批次進(jìn)行檢測，例如，對目的基因表達(dá)產(chǎn)物的確認(rèn)，目的基因的表達(dá)水平，表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性等研究。隨著臨床試驗(yàn)不斷推進(jìn)，持續(xù)完善效價(jià)相關(guān)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的確認(rèn)和效價(jià)控制策略，并盡可能建立關(guān)鍵質(zhì)量屬性與效價(jià)之間的相關(guān)性。產(chǎn)品上市申請階段，效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)限度應(yīng)基于生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)以及產(chǎn)品開發(fā)和臨床研究批次積累的數(shù)據(jù)進(jìn)行設(shè)定，綜合考慮關(guān)鍵臨床試驗(yàn)批次數(shù)據(jù)、方法變異度以及穩(wěn)定性期間的變化情況進(jìn)行修訂和完善。 

通常情況下，不同 rAAV 產(chǎn)品的作用機(jī)制可能不同，一些產(chǎn)品可能含有多種活性成分和/多種生物學(xué)活性，某些產(chǎn)品可能需要測定多種活性成分的濃度和效價(jià)。因此，不同產(chǎn)品效價(jià)檢測方法應(yīng)結(jié)合具體情況具體分析。采用生物學(xué)測定方法作為效價(jià)檢測方法可能受多種因素影響，比如不同儀器之間差異影響，不同分析人員差異影響，以及生物學(xué)測定方法中使用的檢定用細(xì)胞、生物試劑等差異影響。因此，建議盡可能識(shí)別可能影響效價(jià)檢測方法的潛在影響因素，并充分評估這些因素對方法準(zhǔn)確度、精密度等影響。同時(shí)，為進(jìn)一步降低上述因素變異性對效價(jià)測定結(jié)果的影響，可考慮建立對照品/標(biāo)準(zhǔn)品，或者對每個(gè)待測樣品進(jìn)行多次獨(dú)立分析運(yùn)行并報(bào)告平均值。如果產(chǎn)品在研發(fā)期間發(fā)生變更，應(yīng)結(jié)合變更內(nèi)容、變更程度及變更風(fēng)險(xiǎn)提供充分的風(fēng)險(xiǎn)評估和研究數(shù)據(jù)，以證明該變更不會(huì)對產(chǎn)品的效價(jià)產(chǎn)生不利影響。

（六）可復(fù)制型腺相關(guān)病毒（Replication-competent AAV,rcAAV）檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)限度制定的一般要求

1.rcAAV 檢測方法選擇的一般要求

rAAV 產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，由于載體基因組、Rep/Cap 基因以及 ITR 序列可能發(fā)生同源和/或非同源重組，可能會(huì)形成具有復(fù)制能力和潛在感染性的野生型病毒，即 rcAAV。研究顯示，rcAAV 在輔助病毒（例如腺病毒 Ad5）存在條件下可以復(fù)制擴(kuò)增，可能影響產(chǎn)品的安全性，是一種具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的工藝相關(guān)雜質(zhì)。因此，建議將 rcAAV 檢測納入產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了提高檢測方法靈敏度，建議采用細(xì)胞培養(yǎng)法與 PCR 相結(jié)合的方法。

2.rcAAV 檢測方法中陽性對照病毒的一般要求原則上，陽性對照病毒的血清型建議與產(chǎn)品一致。陽性對照病毒可以通過商業(yè)化購買，也可以自行構(gòu)建，但無論通過何種途徑獲得，均應(yīng)提供陽性對照病毒的來源、制備工藝、主要功能元件及感染滴度標(biāo)定等研究資料，并關(guān)注陽性病毒在貯存期間感染滴度的穩(wěn)定性。

3.rcAAV 檢測方法中共培養(yǎng)細(xì)胞選擇的一般要求

考慮到不同血清型病毒對不同細(xì)胞的感染特性或感染能力不同，鼓勵(lì)盡可能基于產(chǎn)品特性篩選易感的細(xì)胞系，其可以通過商業(yè)化購買，也可以自行構(gòu)建，但無論通過何種途徑獲得，均應(yīng)提供檢定用細(xì)胞來源、細(xì)胞庫建庫和檢定等研究資料，關(guān)注細(xì)胞的傳代方式、培養(yǎng)條件等對方法檢測靈敏度的影響。

4.rcAAV 標(biāo)準(zhǔn)限度制定的一般要求？

rcAAV 標(biāo)準(zhǔn)限度應(yīng)在上市階段結(jié)合方法驗(yàn)證結(jié)果、批次數(shù)據(jù)積累、臨床安全性和有效性等情況合理設(shè)定。

（七）殘留宿主 DNA 片段大小質(zhì)量控制的一般要求

1.rAAV 產(chǎn)品中殘留宿主 DNA 大小分布是否需要納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)殘留宿主 DNA 具有潛在的致癌性、感染性及免疫原性，較長片段的宿主 DNA 風(fēng)險(xiǎn)相對較高，因此，建議在臨床試驗(yàn)階段對宿主 DNA 片段大小進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測，積累多個(gè)批次數(shù)據(jù)，并關(guān)注宿主 DNA 片段大小分布變化情況。同時(shí)，根據(jù)臨床期間積累數(shù)據(jù)情況開展充分的安全性評估，基于積累的數(shù)據(jù)和安全性評估情況綜合評估是否納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.殘留宿主 DNA 片段大小控制的一般要求

按照《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的要求，如有可能，建議盡量將殘留 DNA 控制在10ng/劑以內(nèi)，DNA 殘留片段的大小控制在 200bp 以下。鑒于目前部分 rAAV 產(chǎn)品可能難以達(dá)到殘留宿主 DNA 大小＜200bp的要求，建議結(jié)合具體品種類型，以及現(xiàn)有工藝對殘留宿主DNA 片段的去除能力等具體分析，通過開展更加充分的研究和安全性評估數(shù)據(jù)，證明殘留宿主 DNA 片段大小內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)限度擬定的合理性。同時(shí)，基于提高產(chǎn)品質(zhì)量和控制產(chǎn)品安全性，降低潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)工藝相關(guān)雜質(zhì)水平的考慮，鼓勵(lì)申請人通過不斷優(yōu)化生產(chǎn)工藝，盡可能降低>200bp 殘留宿主DNA 片段的比例。

三、參考文獻(xiàn)

1.ICH Q5A(R2). Viral safety evaluation ofbiotechnology products derived from cell lines ofhuman or animal origin.2023.

2.NMPA.體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則.2022.

3.NMPA.重組腺相關(guān)病毒載體類體內(nèi)基因治療產(chǎn)品臨床試驗(yàn)申請藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則.2023.

4.NMPA.溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）.2023.

5.國家藥典委員會(huì).《中華人民共和國藥典》(2025 年版).2025.

6.FDA.Potency tests for cellular and gene therapy products.2011.

7.FDA.Potency assurance for cellular and gene therapyproducts (draft guidance for industry).2023.

來源：CDE

原文下載：重組腺相關(guān)病毒載體類體內(nèi)基因治療產(chǎn)品申報(bào)上市藥學(xué)共性問題與技術(shù)要求.pdf