9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則草案公示稿（第一次）

 9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則為藥物原料、輔料、制藥用水、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品、和環(huán)境、包裝材料和容器等中檢出微生物的鑒定提供指導(dǎo)。當(dāng)鑒定結(jié)果有爭議時，以《 伯 杰 氏 系 統(tǒng) 細(xì) 菌 學(xué) 手 冊 》（《 Bergey’s Manual of Systematic  Bacteriology》）現(xiàn)行版的鑒定結(jié)果為準(zhǔn)。微生物鑒定是指借助現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，通過對未知微生物的特征測定，對其進行細(xì)菌、酵母菌和霉菌大類的區(qū)分，或?qū)佟⒎N及菌株水平確定的過程。微生物鑒定它是藥品微生物檢驗中的重要環(huán)節(jié)，藥典通用技術(shù)要求相應(yīng)章節(jié)中對檢出微生物的鑒定做了明確規(guī)定，如非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:控制菌檢查法（通則 1106）中選擇培養(yǎng)基或指示培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)的疑似菌落需進行鑒定；對無菌檢查法（通則 1101）的陽性實驗結(jié)果中分離的微生物進行鑒定，以判定試驗是否重試；藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則（通則 9205）中建議對潔凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進行鑒定，以掌握環(huán)境微生物污染情況，有助于污染調(diào)查。此外，在藥品生產(chǎn)中，有時亦需對藥物原料、輔料、制藥用水、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品和環(huán)境等中檢出的微生物進行適當(dāng)水平的鑒定。

微生物鑒定需達(dá)到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險評估中，對所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)（桿狀、球狀、細(xì)胞群、孢子形成模式等）、革蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應(yīng)（如氧化酶、過氧化氫酶和凝固酶反應(yīng)）進行分析，一般即可滿足需要；非無菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應(yīng)達(dá)到藥典規(guī)定的水平；無菌試驗結(jié)果陽性、無菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗、環(huán)境嚴(yán)重異常事件時，對檢出的微生物鑒定至少達(dá)到種水平，必要時需達(dá)到菌株水平。微生物的鑒定程序微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定時，一般先將待檢菌進行初步的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定，根據(jù)所需達(dá)到的鑒定水平選擇合適的鑒定方法。微生物鑒定系統(tǒng)是基于不同的分析方法，其局限性鑒定能力與方法和數(shù)據(jù)庫的局限性息息相關(guān)，未知菌鑒定時通過與微生物鑒定系統(tǒng)中的參考微生物（模式菌株、標(biāo)準(zhǔn)菌株或經(jīng)確認(rèn)的菌株等）的特征（基因型和/或表型）相匹配來完成。如果數(shù)據(jù)庫中沒有對應(yīng)的菌株信息，就無法獲得正確的鑒定結(jié)果。在日常的微生物鑒定試驗中，用戶應(yīng)明確所采用鑒定系統(tǒng)的局限性及所要達(dá)到的鑒定水平（屬、種、菌株），選用最適合要求的鑒定技術(shù)，必要時采用多種鑒定方法進行確定。

待檢菌的分離純化 微生物鑒定的第一步是待檢培養(yǎng)物的分離純化，最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化，以獲取待檢菌的培養(yǎng)物（單個菌落）,必要時可進一步進行純培養(yǎng)，為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量菌體。從藥物原材料、輔料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)品和、終產(chǎn)品、環(huán)境、包裝材料和容器等的樣品中檢出的受損微生物，經(jīng)分離純化程序使其由不利生存易產(chǎn)生變化的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵跔I養(yǎng)富集和最佳培養(yǎng)溫度條件下生存的穩(wěn)定狀態(tài)，以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

 初篩試驗

常規(guī)的微生物鑒定，一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征，將待檢菌做初步分類。常見的初篩試驗包括形態(tài)觀察、染色鏡檢（或氫氧化鉀拉絲試驗）、重要的生化反應(yīng)等。

 重要的生化篩選試驗包括：

氧化酶試驗 用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）。過氧化氫酶試驗 用于區(qū)分葡萄球菌（過氧化氫酶陽性）和鏈球菌（過氧化氫酶陰性）。凝固酶試驗 用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌（很可能為可能具有致病性）。初篩試驗可為評估提供有價值的信息，對于微生物鑒定方法來說，初篩試驗是非常最關(guān)鍵的一步，若給出了錯誤的結(jié)果，將影響后續(xù)試驗，包括微生物鑒定試劑盒或相關(guān)引物等的選用。

表型微生物鑒定

表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達(dá)來區(qū)分不同微生物間的差異，是經(jīng)典的微生物分類鑒定法，以微生物細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性表型為主要指標(biāo)，通過比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進行鑒別。微生物分類中常用的表型特征見表 1。

微生物細(xì)胞的大小和形態(tài)、芽孢、細(xì)胞成分、表面抗原、生化反應(yīng)和對抗菌劑的敏感性等表型的表達(dá)，除受其遺傳基因的控制外，還與微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長條件等因素有關(guān)。表型微生物鑒定通常需要大量的純培養(yǎng)物，而微生物的恢復(fù)、增殖和鑒定易受培養(yǎng)時間影響，事實上許多環(huán)境微生物在普通的微生物增殖培養(yǎng)基中是無法恢復(fù)的；此外，一些從初始培養(yǎng)物中剛分離出的受損微生物還可能不能完整地表達(dá)其表型屬性。因此，在表型鑒定時應(yīng)注意采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)對鑒定結(jié)果的影響。目前已有的基于化學(xué)分類的鑒定方法，如氣相色譜法分析微生物的脂肪酸特征、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF MS）質(zhì)譜法分析微生物的特征蛋白等微生物鑒定系統(tǒng)，在進行結(jié)果判斷時需借助于系統(tǒng)自身的鑒定數(shù)據(jù)庫，還依賴特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法以確保鑒定結(jié)果的一致性。

表型微生物鑒定方法已廣泛應(yīng)用于藥品微生物實驗室。根據(jù)微生物表型鑒定所提供的信息可以判斷藥品中污染的微生物種類，也可掌握環(huán)境微生物菌群的變化，并進行產(chǎn)品的風(fēng)險評估。在許多質(zhì)量控制調(diào)查中，表型鑒定結(jié)果能給出一定的信息幫助調(diào)查人員進行深入調(diào)查，并按需要制定適宜的糾正措施。

基因型微生物鑒定 與表型特征不同，微生物基因型通常不受生長培養(yǎng)基或分離物活性的影響，只需分離到純菌落便可用于分析。由于大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的，所以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），DNA 探針、DNA-DNA 雜交，多位點序列分型、核糖體分型分析，16S 核糖體 RNA（16S ribosomal RNA）核酸測序、18S 核糖體 RNA（18S ribosomal RNA）核酸測序、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）核酸測序和全基因組核酸測序等基因型微生物鑒定方法理論上更值得信賴。基因鑒定方法通常在無菌檢查試驗結(jié)果陽性、非無菌藥品控制菌檢查中疑似菌的鑒定、環(huán)境監(jiān)控異常、偏差調(diào)查、培養(yǎng)基模擬灌裝失敗等微生物調(diào)查中使用。

目前《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》中對細(xì)菌分類的描述是通過遺傳物質(zhì)的分析比較來實現(xiàn)的。通過未知微生物的 DNA 與已知微生物的 DNA 比較，能夠確定親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。基因型的鑒定可通過 DNA 雜交、限制性酶切片段圖譜的比較和/或 DNA 探針完成，比如在圖譜分析中，若 DNA-DNA 的雜交親緣關(guān)系大于 70%時，可判定相關(guān)微生物是屬于同一個種屬；表 2 系統(tǒng)發(fā)育典型的分析方法通過比較細(xì)菌 16S rRNA 基因，真菌 18S rRNA 基因、ITS 區(qū)域堿基核酸序列來實現(xiàn)，即經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR 進行基因擴增、電泳分離擴增產(chǎn)物、以雙脫氧鏈終止法進行核酸堿基測序，然后與經(jīng)驗證過的專業(yè)用數(shù)據(jù)庫或利用公共數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定分析。

表 2 微生物分類學(xué)的基因型/系統(tǒng)發(fā)育的特征

限制性酶切片段圖譜和 DNA 探針系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu) 16S rRNA 基因序列、18S rRNA 基因序列、26S rRNA 基因序列、ITS 序列、全基因組序列基于核酸的方法可以用來篩選處于過渡期受損的微生物。將存在于過渡期與菌株生存能力相關(guān)的 rRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄的方法轉(zhuǎn)換為可用于 PCR 擴增的 DNA。解決了不能存活可培養(yǎng)的微生物細(xì)菌細(xì)胞中 DNA 的擴增問題。該方法經(jīng)過樣品收集、核酸提取、目的片段擴增和檢測等步驟，涉及了變異微生物的檢測、檢測限、基質(zhì)效應(yīng)、正向截點的核查、儀器設(shè)備和系統(tǒng)攜帶污染、分析的精確性和試驗的重現(xiàn)性等內(nèi)容。 rRNAs 記錄了微生物的進化歷史，對這些序列進行分析可以對微生物進行系統(tǒng)分類和鑒定。

微生物鑒定方法的確認(rèn)微生物鑒定系統(tǒng)的確認(rèn)試驗按下述方法之一進行：①采用現(xiàn)有方法和待確認(rèn)方法對日常檢驗中分離的微生物約 50 株進行平行鑒定試驗，鑒定結(jié)果的差異可使用仲裁方法判定。②使用 12~15 種已知的能代表常規(guī)分離到的微生物的儲備菌種，共進行 50 次鑒定試驗。③待確認(rèn)方法對 20~50 株微生物（包括 15~20 個不同的種）進行鑒定，結(jié)果應(yīng)與參照實驗室的鑒定結(jié)果一致。確認(rèn)試驗所用的菌株應(yīng)包括鑒定方法供應(yīng)商和藥典推薦的適宜質(zhì)控菌株。對所用的微生物鑒定系統(tǒng)的鑒定結(jié)果應(yīng)進行評估，同時還應(yīng)考慮其一致性水平。合適的微生物鑒定系統(tǒng)中，試驗菌株與參考微生物的一致性水平通常應(yīng)大于 90%。若可能，微生物鑒定方法確認(rèn)所用的挑戰(zhàn)微生物應(yīng)包括非發(fā)酵型細(xì)菌、棒狀桿菌和凝固酶陰性的葡萄球菌等，但其一致性水平可能比較低。微生物鑒定系統(tǒng)不能鑒定所有的微生物，因為數(shù)據(jù)庫中未包含此微生物，或系統(tǒng)參數(shù)無法充分識別該微生物，或該微生物在系統(tǒng)中無反應(yīng)、或該微生物尚未被分類描述等。錯誤鑒定結(jié)果確認(rèn)是比較難的，任何微生物鑒定都應(yīng)從微生物形態(tài)學(xué)、生理要求和微生物來源等多方面判斷鑒定結(jié)果是否合理。錯誤的鑒定會導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)募m正和預(yù)防措施及產(chǎn)品處置。微生物鑒定方法的確認(rèn)應(yīng)包括準(zhǔn)確度、專屬性、重現(xiàn)性、靈敏度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。確認(rèn)試驗最重要的是準(zhǔn)確度性和重現(xiàn)性。這些測量值按下述定義：準(zhǔn)確度性(%) =（結(jié)果正確的數(shù)量/總的結(jié)果數(shù)量）× 100%,重現(xiàn)性(%)=（結(jié)果正確且達(dá)到一致性的數(shù)量/總的結(jié)果數(shù)量）× 100%用戶應(yīng)該考慮鑒定方法的適用性，建立準(zhǔn)確度性和重現(xiàn)性的接受標(biāo)準(zhǔn)。

其它測定值如靈敏度性、專屬性、陽性或陰性預(yù)測值。通過以下例子能很好的說明這些測定值。例如，臨床微生物實驗室，分別用 DNA 雜交探針和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法處理了 100 個臨床樣本，前者陽性結(jié)果比后者高 10%，結(jié)果列于表。

應(yīng)注意到試驗的陽性預(yù)測值不是固定的，它取決于臨床樣本中微生物的普遍程度。陽性預(yù)測值與流行疾病和條件成正比。如果在一組人群試驗中感染人數(shù)比例較高，則陽性預(yù)測值較高，陰性預(yù)測值較低。如果組中所有人都被感染，則陽性預(yù)測值為 100%，陰性預(yù)測值為 0%。這些函數(shù)引出的數(shù)字列于表中。

表 4 關(guān)于培養(yǎng)方法和替代方法 PCR 法的兩行兩列表

系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)內(nèi)容

《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》（第二版）內(nèi)容是依據(jù)核糖體小亞基 16S rRNA的核苷酸序列分析，按照系統(tǒng)發(fā)育為框架編寫的，而不是按照表型結(jié)構(gòu)編寫的。

系統(tǒng)發(fā)育樹或樹狀圖可顯示遺傳關(guān)系最接近的微生物，這項技術(shù)的應(yīng)用導(dǎo)致了分類的修正和一些已知微生物的重命名，如真菌黑曲霉 ATCC16404 被重名為巴西曲霉。系統(tǒng)進化分析中，一般而言，同源性小于或等于 97%被認(rèn)定為不同的屬，同源性小于或等于 99%被認(rèn)定為不同的種，但是這種普遍性有很多的例外情況。

基因型鑒定與表型鑒定的結(jié)果差異的情況相對比較少見，例如，具有相同或非常相似基因型的微生物具有不同的表型、具有相似表型的卻具有不同的基因型，以及基因型遺傳距離較很遠(yuǎn)的微生物不能被歸為同種或同屬。多相分類學(xué)的概念是匯集和吸收了分子生物學(xué)、生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、血清學(xué)或生態(tài)學(xué)資源的等多層信息進行微生物分類，例如，微生物特征描述、表型和基因數(shù)據(jù)及微生物來源等，都可被成功地應(yīng)用于微生物鑒定中，以避免因使用單一鑒定方法做出毫無意義錯誤的結(jié)論。

溯源分析

溯源分析是通過對目標(biāo)污染微生物和相關(guān)環(huán)節(jié)監(jiān)控發(fā)現(xiàn)的同種微生物進行比對，以菌株之間同源性的差異程度為依據(jù)，確認(rèn)目標(biāo)污染微生物來源的過程。實現(xiàn)目標(biāo)微生物有效的溯源調(diào)查分析，一般需采用較高分辨力的菌株分型和鑒定方法對相關(guān)微生物進行同源性分析。

菌株水平的鑒定在污染調(diào)查過程中非常重要，尤其適用于產(chǎn)品中的微生物數(shù)量高于建議水平或出現(xiàn)異常高的微生物檢出情況時。菌株水平的鑒定在無菌工藝中也很重要，在無菌試驗結(jié)果陽性和培養(yǎng)基灌裝等模擬工藝失敗時，應(yīng)對檢出的微生物進行評估。

同一地點的同種菌，其表型特征和基因型特征是基本一致的。不同地點的同種菌，表型特征可能基本一致，但保守及可變區(qū)域的基因特征序列會有一定的差異性。因此，污染調(diào)查等應(yīng)以基因型特征鑒定為主，表型特征鑒定為輔。

菌株分型通常需在菌種鑒定基礎(chǔ)上開展。常見的菌株分型方法包含限制性核酸內(nèi)切酶 Southern 雜交方法、脈沖場凝膠電泳方法、多位點序列分型、全基因組測序方法等。細(xì)菌 16S rRNA 基因核酸序列和真菌的 ITS 核酸序列在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度保守性，是微生物核酸測序鑒定和分類中得到廣泛應(yīng)用的 DNA 特征性核酸序列之一，方法易標(biāo)準(zhǔn)化，鑒定結(jié)果可以滿足一般菌株鑒定的要求。限制性核酸內(nèi)切酶進行酶解的 Southern 雜交根據(jù)菌株基因組

DNA 中的特定區(qū)域是否具有相似的酶切位點，是否可得到一致的酶切雜交譜帶，進行菌株的鑒定和分類，適用于菌株之間的同源性分析。脈沖場凝膠電泳是根據(jù)菌株基因組 DNA 中限制性內(nèi)切酶酶解后條帶的數(shù)量和大小，進行菌株分型的技術(shù)手段，應(yīng)用于菌株之間的同源性分析時，結(jié)果較限制性核酸內(nèi)切酶酶解的方法更準(zhǔn)確。全基因組核酸測序可以得到菌株核酸水平的全部遺傳信息，通過核酸序列的比對分析，進行菌株的鑒定、分型與溯源，結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確，是溯源分析技術(shù)發(fā)展的主要趨勢。

不同菌株分型方法原理和效果具有一定差異性，溯源調(diào)查時應(yīng)根據(jù)菌株自身特點和應(yīng)用場景選擇適合的方法，采用基因型鑒定方法或多種方法聯(lián)用，并結(jié)合菌株來源數(shù)據(jù)等信息進行綜合判斷，實現(xiàn)目標(biāo)微生物的溯源調(diào)查分析。在區(qū)分同源性高的不同種或同種中的不同株時，應(yīng)根據(jù)需要，采用適宜的基因型鑒定方法或采用多種方法聯(lián)用，對鑒定結(jié)果進行確認(rèn)。

實際工作中無菌試驗陽性結(jié)果中分離出的微生物，經(jīng)對其溯源分析，確認(rèn)污染歸因于無菌試驗過程中所使用的材料或無菌技術(shù)的差錯，該試驗可判無效，否則判該產(chǎn)品不符合要求。對潔凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進行適當(dāng)?shù)蔫b定，掌握環(huán)境微生物污染情況，有助于污染調(diào)查。

高分辨力的菌株分型方法能夠有效實現(xiàn)菌株水平的鑒定，這對于微生物污染調(diào)查分析非常重要，尤其適用于產(chǎn)品中的微生物數(shù)量高于建議水平或標(biāo)準(zhǔn)限值時。菌株水平的鑒定在無菌保障中也很重要，在無菌試驗結(jié)果陽性和培養(yǎng)基灌裝等模擬工藝失敗時，應(yīng)對檢出的微生物進行溯源調(diào)查及評估分析。其中無菌試驗結(jié)果陽性，經(jīng)溯源調(diào)查分析，確認(rèn)污染歸因于無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的，或無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求等因素，可判該試驗結(jié)果無效。

對藥物原料、輔料、制藥用水、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品、環(huán)境、包裝材料和容器等開展有效的監(jiān)控分析，并對分離到的微生物進行適宜水平的種屬鑒定，基于種群多樣性趨勢分析建立生產(chǎn)過程微生物分布地圖，充分掌握藥品及生產(chǎn)全過程微生物污染情況，有助于污染微生物的溯源調(diào)查。

為了確證微生物為同種中的兩個相同株，需比對更多的基因序列和特征基因片段，甚至是全基因組序列的比對，實現(xiàn)既鑒定又溯源的目的，同時保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，有些微生物的溯源還需結(jié)合表型特征鑒定，如沙門菌屬的血清型鑒定。

起草單位：上海市食品藥品檢驗研究院 聯(lián)系電話：18001677839

復(fù)核單位：天津市藥品檢驗研究院

9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則修訂說明

經(jīng)過國內(nèi)外現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)比對分析、執(zhí)行反饋問題評估等，《中國藥典》四部通則 9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容比較完善，引入了微生物鑒定與溯源相關(guān)的新技術(shù)和新方法。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)實施和企業(yè)實踐中遇到的問題反饋，對標(biāo)準(zhǔn)進一步修訂完善。

主要修訂內(nèi)容包含：

1、在“溯源分析”章節(jié)增明確了溯源調(diào)查相關(guān)要求。強調(diào)日常環(huán)境監(jiān)控和微生物鑒定分析的重要性。提出對分離到的微生物進行適宜水平的種屬鑒定，基于種群多樣性趨勢分析建立生產(chǎn)過程微生物分布地圖，充分掌握藥品及生產(chǎn)全過程微生物污染情況。此外，調(diào)整了相關(guān)段落的邏輯順序。

2、對標(biāo)準(zhǔn)全文中的部分描述進行了修訂完善。

來源：藥典委

附件 9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則草案公示稿（第一次）.pdf