腺相關病毒載體基因治療產品非臨床研究技術指導原則

一、概述

（一）前言

體內基因治療產品一般選用適當的載體或轉染方式將外源基因（或基因編輯工具）導入人體，通過替代、補償、阻斷、修正特定基因以達到治療疾病的目的。腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體因其理化性質穩定、致病性弱、整合風險低、目的基因表達持久等結構和生物學方面的優勢，成為體內基因治療領域研究和應用最廣泛的載體之一。

本指導原則所指 AAV 載體基因治療產品（以下簡稱為“AAV 載體產品”）是以 AAV 載體攜帶含目的基因的基因表達元件，通過目的基因在體內發生轉錄、翻譯，獲得目的蛋白并在體內長期表達來發揮治療作用。該類產品的潛在風險分析時需考慮終產品、所采用的 AAV 載體、遞送的目的基因等，還需關注體內長期存續和/或表達帶來的長期安全性風險。為規范和指導 AAV 載體產品的非臨床研究和評價，在相關非臨床研究指導原則基礎上，基于現階段對于此類產品的科學認知，制定本指導原則，提出非臨床研究和評價的要求。隨著技術的發展、認知程度的深入和相關研究數據的積累，本指導原則將不斷完善和適時更新。

（二）適用范圍 

本指導原則中的 AAV 載體是指基于腺相關病毒的結構、理化和生物學特性，經設計和重組改造所形成的用于攜帶目的基因的病毒載體。本指導原則為此類 AAV 載體產品的非臨床研究提供技術指導和建議。對于攜帶基因編輯工具的 AAV 載體產品，其作用機制涉及對人體細胞基因組的編輯操作，現階段對此類產品的認知有限，因此本指導原則不適用于此類產品。

二、總體考慮

（一）研究目的

非臨床研究是藥物開發的重要組成部分。AAV 載體產品非臨床研究的主要目的是：（1）對擬定的作用機制進行概念驗證，考察有效性潛力，明確其在擬定患者人群中使用的生物學合理性。通常包括：考察其攜帶的目的基因能否進入預期的靶細胞并表達為具有生理學功能的蛋白產物、蛋白產物能否對擬定適應癥起到治療作用等。（2）考察 AAV 載體產品在體內的藥代特征，評估其生物分布、存續、脫落特征。（3）根據潛在風險因素，闡明毒性反應特征，預測人體可能出現的不良反應，確定臨床監測指標，為制定臨床風險控制措施提供參考信息。

應通過開展非臨床研究，收集用于獲益-風險評估的信息，以確定擬開發產品在目標患者人群中預期具有合理的、可接受的獲益-風險比，同時為臨床試驗的設計和風險控制策略的制定以及產品上市提供支持性依據。

（二）基本原則

1. 具體問題具體分析

由于 AAV 載體產品的生物學復雜性，其非臨床研究和評價應遵循“具體問題具體分析”的原則，綜合考慮導入的目的基因特性、AAV 載體生物學特征、研究模型的可行性/可獲得性、適應癥/目標患者群體、給藥途徑和給藥方案等多種因素。

2. GLP 要求

AAV 載體產品的非臨床安全性研究一般應當在經過藥物非臨床研究質量管理規范（GLP）認證的機構開展，并遵守 GLP。當某些特殊情況下無法遵守 GLP 時，例如采用非常規動物模型、在概念驗證或生物分布試驗中整合安全性檢測指標、檢測某些特殊指標等，應最大限度地按 GLP 原則進行試驗，確保試驗質量和數據的完整性及可追溯性。

3. 隨機、對照、重復

試驗應遵循隨機、對照、重復的原則。

（三）非臨床研究的重要關注點

1. 受試物

非臨床研究所用受試物應能代表臨床擬用樣品。應明確受試物質量特性。若后續開發階段藥學方面發生變更，需評估變更帶來的影響，必要時開展變更前后樣品的非臨床橋接研究或開展新的非臨床研究。AAV 載體產品的終產品中，除擬發揮療效的活性成分外，通常還存在多種相關雜質，如空殼病毒、部分包裝病毒、游離衣殼蛋白、游離核酸、DNA 錯誤包裝等。活性成分與相關雜質的含量及比例可能影響 AAV 載體產品發揮藥效作用或引起安全性風險的劑量水平，因此，整個非臨床和臨床開發過程中保持產品特性的一致性對于有效性和安全性至關重要。需要對產品的純度、雜質進行檢測和控制。當無法采用臨床擬用產品進行動物試驗而采用攜帶動物源基因表達元件的替代 AAV 載體產品開展試驗時，該替代產品應與臨床擬用產品采用相似的生產工藝，并對可能影響有效性和安全性的關鍵質量參數進行對比研究，以評估替代產品與臨床擬用產品的相似性及其對非臨床數據預測性的影響。

2. 動物種屬/模型選擇

應選擇相關動物種屬/模型進行非臨床體內研究。動物種屬/模型的選擇應具有科學合理的依據。選擇相關動物時需要考慮產品特性和臨床擬用情況，包括但不限于以下因素：

（1）AAV 載體在動物中的感染敏感性、組織趨向性、轉導效率及與人體的相似性；

（2）動物對 AAV載體攜帶的目的基因的轉錄和/或表達可行性及其表達產物的生物學效應與預期的人體效應的相似性；

（3）動物對 AAV載體產品的免疫耐受性；

（4）動物的解剖學和病理/生理學特征與擬定適應癥人群的相似性；

（5）臨床擬用給藥途徑、給藥方式的可行性。由于野生型 AAV 的宿主較為廣泛，當實驗動物體內存在針對野生型 AAV 的預存抗體時，可能會影響 AAV 載體產品給藥后的體內暴露，進而影響對有效性和安全性的評價。因此，在動物篩選及分組時需關注預存抗體及其對體內藥物暴露的可能影響，盡量選擇預存抗體陰性的動物用于試驗。

采用疾病動物模型開展的研究可以同時提供 AAV 載體產品的藥理活性和毒性信息，也可以模擬臨床患者的病理生理狀態，因此，必要時可考慮采用疾病動物模型進行非臨床安全性研究。

在某些情況下可以考慮使用動物源性替代產品，例如，當來自目的基因的蛋白質由于生物活性的種屬差異而不能在動物中發揮其預期作用時，可以使用來自動物的同源基因構建的替代產品。需要注意的是，使用替代產品開展的非臨床安全性研究在一定程度上可用于識別風險，但是并不適合用于定量風險評估。

對于擬用于兒科人群的 AAV 載體產品，ICH S11 適用范圍不包括基因治療產品，同時指出基因治療產品可參考該指導原則關于利用現有信息評估安全性的一些思路，但是，由于 AAV 載體產品的特殊性，應充分評估其在兒科人群中的潛在風險。對于首次臨床試驗擬采用兒科人群（例如適應癥僅限于兒科人群），考慮進行幼齡動物毒理學試驗。若給藥可能對兒科人群發育中的器官系統帶來較大的安全性風險時，應進行幼齡動物毒理學試驗。

3. 給藥方式/途徑

非臨床研究中的給藥方式/途徑應能最大程度模擬臨床擬用給藥方式/途徑。如果在動物試驗中采用其他的給藥方式/途徑，應闡明其科學性和合理性依據。

4. 組織趨向性和體內存續性

不同血清型 AAV 載體的組織趨向性特征存在差異，然而，這種組織趨向性并不意味著該載體不分布至其他組織器官，因此需通過生物分布研究來考察 AAV 載體產品的靶向和非靶向特征及其風險。另外，AAV 載體的組織趨向性也可能存在種屬差異，而 AAV 載體產品在動物與人體之間組織趨向性的差異會影響動物試驗對有效性和安全性的預測價值，因此，謹慎將非臨床研究中獲得的動物數據直接外推至人。

AAV 載體產品攜帶的目的基因及其表達產物在靶器官/組織中的長期存續性，是該類產品起效的關鍵決定因素，而AAV 載體產品及其表達產物在非靶部位的存續則可能帶來安全性風險，因此，AAV 載體產品非臨床研究時需充分考慮目的基因及其表達產物的存續性。

5. 非臨床試驗的整合設計

基于 AAV 載體產品的特點、相關動物種屬/模型的可獲得性，某些非臨床試驗可整合在其他試驗中進行。例如，如果可行且科學合理，在疾病動物模型的藥效學試驗中伴隨考察毒理學指標，將藥代動力學試驗整合至藥效學試驗和/或毒理學試驗中。整合試驗設計有助于闡明藥代動力學、藥效、毒性的相關性。

三、基本內容

（一）藥理學研究

應通過藥理學試驗闡述 AAV 載體產品的生物學作用和作用機制，提示其在擬定患者人群中使用的生物學合理性。AAV 載體產品的藥理學試驗通常包括體外和體內試驗。體外試驗主要用于評價 AAV 載體產品的轉導效率、導入基因的表達情況、表達產物的活性等。體內試驗應在與人類疾病相關的疾病動物模型中研究 AAV 載體產品是否可發揮預期的藥理學作用，通過對 AAV 載體產品在預期靶器官/組織的分布特征、其攜帶的目的基因和/或其表達產物在預期靶器官/組織的表達情況、疾病相關指標的改善情況等，來評價產品的有效性潛力。

（二）藥代動力學研究

1. 生物分布

AAV 載體產品的生物分布研究信息對提示其有效性和安全性至關重要。應參考 ICH S12 對基因治療產品非臨床生物分布研究的一般要求，采用相關動物種屬開展生物分布試驗，以闡明 AAV 載體產品在體內的命運和行為。根據產品特性，檢測與藥效和毒性相關的藥代動力學行為，如 AAV 載體的生物分布、存續和清除特征，攜帶的目的基因及其表達產物在體內的分布特征等。疾病動物模型可能對評估 AAV 載體產品的分布特征更有意義，鼓勵在藥效學試驗中伴隨生物分布研究。

AAV 載體產品生物分布研究應采用合適的劑量，以臨床擬用的給藥途徑，在相關動物種屬或動物模型中開展。需要檢測載體水平和目的基因水平。由于 AAV 載體產品最終發揮藥理作用的物質為目的基因的表達產物，因此，在方法可行的情況，需要檢測表達產物。采樣時間點的選擇應足以反映 AAV 載體產品隨時間發生改變的特征，至少包括在靶組織和非靶組織的峰值和穩態階段，并考慮評估長期持續性。應在每個預設采樣時間點評價每種性別（如適用）適當數量的動物，以產生足夠的數據來支持全面的生物分布評價。應提供動物數量的科學依據。一般情況下，建議每個性別/組/時間點至少評估 5 只嚙齒類動物或 3 只非嚙齒類動物。生物分布研究的檢測方法應經過方法學驗證。AAV 載體產品生物分布研究的組織應至少包括給藥部位、性腺（卵巢/睪丸）、腎上腺、腦、脊髓（頸髓、胸髓、腰髓）、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、肌肉、血液。另外，需要根據產品特征增加特定的組織器官，例如：AAV 載體的組織趨向性、目的基因的表達產物可能發揮作用的組織；根據給藥途徑和同類品種信息所提示的潛在毒性靶器官增加其他相關的組織，包括與給藥途徑相關的淋巴結、給藥部位附近的組織[如鞘內注射的腦脊液、脊神經根（包括前根和后根）、背根神經節等]、外周神經、視神經、眼部組織（如眼科用藥）等。此外，免疫原性可能對生物分布產生影響，因此，在生物分布研究時，建議采集樣本以備必要時進行免疫原性檢測，以支持對生物分布數據的解釋。

2. 脫落

脫落是指 AAV 載體通過排泄物（尿液、糞便）、分泌物（唾液等）或其他方式排出體外。應開展 AAV 載體產品的脫落研究。脫落研究可整合至生物分布研究或其他非臨床研究中。

（三）非臨床安全性研究

在制定非臨床安全性研究策略時，應根據 AAV 載體產品本身的特點以及每個產品的特點，按照基于風險的原則具體問題具體分析，總體目的是充分提示產品潛在的安全性風險。

1. 安全藥理學

在首次臨床試驗前，應采用合適的動物種屬開展 AAV 載體產品的安全藥理學試驗，一般包括中樞神經系統、心血管系統、呼吸系統安全藥理學試驗。這些試驗可整合在一般毒理學試驗中進行，若整合進行，需滿足安全藥理學評價要求，同時檢測時間點應符合 AAV 載體產品的特點。若無法進行或不進行，應提供充分的理由。在必要時，可能需要開展補充和追加的安全藥理學試驗。對于腦內給藥的 AAV 載體產品，需重點關注對神經系統功能的影響，結合藥物在腦內不同區域的分布及存續特征，分析對具體神經功能影響的可能性，可單獨開展試驗評價，也可結合在藥效學試驗或毒理學試驗中設置相應的檢測指標。

2. 一般毒理學

一般毒理學試驗主要用于評價 AAV 載體產品的全身毒性和局部毒性、急性毒性和長期毒性或延遲毒性、劑量和效應關系等。應基于 AAV 載體產品的生物學特性、可能的風險因素和安全性擔憂，采用基于風險、科學導向的靈活設計方案。

2.1 動物種屬選擇

關于毒理學試驗動物種屬的選擇，應基于動物種屬的藥理學相關性、相關動物種屬/模型的可獲得性等因素綜合考慮，總體目標是盡可能最大程度地闡明 AAV 載體產品的安全性特征，為人體安全性提供有價值的預測信息。在可行的情況下，應獲得兩種相關動物種屬（通常包括嚙齒類動物和非嚙齒類動物）的非臨床安全性信息。若僅采用一種相關動物，應提供科學合理的依據。動物種屬選擇的考慮因素參考本指導原則“二、總體考慮”項下“2.動物種屬/模型選擇”的建議。通常采用雌雄兩種性別動物進行試驗。若采用單性別進行試驗，應提供合理性依據。

2.2 分組和劑量設計

通常情況下，一般毒理學試驗中的給藥劑量應包括多個劑量。合適的劑量間距，有助于評估毒性反應-劑量關系的陡峭程度和Ⅰ期臨床劑量遞增方案的設計。低劑量一般對應于預期的有效劑量。高劑量一般為了產生毒性反應或提供足夠的安全窗，高劑量的設置可能會受到動物模型、給藥部位容量/大小、給藥途徑和制劑最高濃度等限制，可選擇最大可行劑量作為高劑量。需結合處方組成和生產工藝，設置合適的對照組（例如溶媒、輔料、空載體、含有非功能基因的載體等對照組），以幫助確定試驗中發現的不良結果是否與受試物相關。當使用疾病動物模型作為實驗系統時，應考慮設計模型對照組。

2.3 給藥方案和觀察期限

試驗中的給藥方案應最大程度地模擬臨床擬用給藥方案，給藥途徑應能反映臨床使用情況。毒理學試驗的給藥次數一般基于擬定的臨床給藥次數而設計。AAV 載體產品臨床上通常為單次給藥，在體內長期存續發揮作用，因此，一般毒理學試驗通常采用單次給藥，根據產品的作用特點（如載體在體內存續時間、目的基因及其表達產物表達的相關信息等），確定總觀察期限。需闡述觀察期限設計的合理性。通常一般毒理學試驗的總觀察期限不短于 6 個月，更長的觀察期限更有利于觀察長期毒性或延遲毒性（注釋 1）。

一般毒理學試驗應包括多個解剖時間點（注釋 2），以評估可能的急性毒性及其恢復情況、長期存續導致的長期毒性或延遲毒性，并評價產品發揮作用的持續性，以及劑量/暴露量與毒性反應、生物分布與毒性反應的關系。

2.4 檢測指標

除一般毒理學試驗的常規觀察指標外，需結合 AAV 載體產品特性，增加合適的觀察指標，如免疫原性、免疫毒性、腦內給藥的神經毒性、眼內給藥的眼毒性，以及基于同類品種發現的值得關注的安全性信號，在一般毒理學試驗中設置特異性的毒性檢測指標，并采用敏感的檢測方法。應設置合適的時間點以能敏感地檢測到對相關指標的影響。在一般毒理學試驗中需伴隨進行毒代研究，考察 AAV 載體產品中載體和目的基因在體內的轉錄/翻譯、分布、存續情況，為毒性試驗的結果解釋提供支持性數據（必要時設置衛星組），還可伴隨開展脫落研究。

3. 免疫原性

影響藥物免疫原性的因素復雜，對于 AAV 載體產品，機體可能存在對于野生型 AAV 的免疫記憶、AAV 載體誘導的先天性免疫和適應性免疫、表達產物誘導的免疫反應，因此，AAV 載體產品更容易引起免疫原性，應采用合適的方法開展免疫原性研究，包括對 AAV 載體和表達產物的免疫原性。實驗動物體內的預存抗體可能會影響 AAV 載體產品的體內暴露，進而對有效性和安全性評價產生影響。如果試驗中納入少量預存抗體滴度低的動物時，應評估預存抗體對試驗結果的影響。

4. 遺傳毒性

通常標準的遺傳毒性組合試驗不適用于 AAV 載體產品的遺傳毒性評價。通常認為野生型 AAV 主動整合至宿主基因組中的概率低，但是與野生型 AAV 相比，AAV 載體產品的基因組整合特性可能會發生改變。若 AAV 載體產品整合至宿主基因組中，可能會導致宿主遺傳物質改變和后續不良生物學效應。因此，應進行基因組整合分析，當存在整合至宿主基因組中的可能性時，需分析基因組整合位點及可能帶來的安全性風險。

5. 致癌性

標準的嚙齒類動物致癌性試驗一般不適用于評價 AAV載體產品。可采用證據權重（Weight of Evidence，WoE）方法來評估致癌性風險，必要時進行致癌性相關研究。WoE 評估因素一般包括但不限于：

（1）導入的目的基因和藥理作用通路與腫瘤發生發展的相關性；

（2）潛在的基因組整合風險、基因組整合分析數據；

（3）一般毒理學試驗中癌前病變或腫瘤發生相關的組織病理學發現；

（4）生產體系中可能存在的潛在致癌成分；

（5）其他可能與人體內腫瘤發生相關的因素。

6. 生殖毒性

AAV 載體產品應根據產品特性、作用機制、臨床適應癥和擬用人群、一般毒理學試驗中的發現、生物分布和脫落特征等信息評估潛在的生殖和發育毒性風險。生殖毒性試驗的研究策略和風險評估可參考相關指導原則。AAV 載體產品需關注生殖系傳遞風險。當 AAV 載體產品在性腺持續存在時，需要進一步研究其在生殖細胞（例如卵母細胞、精子）的暴露水平，如有暴露，開展生殖系傳遞試驗。

7. 制劑安全性

應根據 AAV 載體產品的特點和臨床應用情況考慮開展終產品制劑的刺激性、溶血性試驗。

8. 其他

應基于產品特性及風險，考慮開展必要的其他試驗。

四、注釋

注釋 1：AAV 載體產品一般毒理學試驗的觀察期限如何設置，尚需不斷積累經驗。基于產品設計原理，此類產品通常在體內長期存續發揮作用，一般毒理學試驗需要考察長期毒性或延遲毒性，因此，建議根據產品的作用特點（如載體在體內存續時間、目的基因及其表達產物表達的相關信息等），確定總觀察期限。基于當前認知，建議一般毒理學試驗的總觀察期限不短于 6 個月，但是在可行的情況下或者是為了考察特殊的毒性特征，更長的觀察期限更有利于觀察長期毒性或延遲毒性。

另外，基于同類產品的毒理學信息或受試物前期已有的毒理學試驗結果提示具有特殊的毒性風險，而需要考察受試物的該毒性風險是否進展或是否能逐漸恢復時，需考慮進行更長期限的觀察。

注釋 2：關于 AAV 載體產品一般毒理學試驗的解剖時間點的設計，考慮到該類產品通常在體內長期存續發揮作用，需要通過多個解剖時間點來考察藥物引起的毒性反應特征（例如急性毒性、長期毒性或延遲毒性、毒性可逆性等），但是，在一項試驗中不一定需要或能夠包括所有解剖時間點，可以在不同觀察期限試驗中涵蓋這些時間點。對其具體時間點的設置，尚需不斷積累經驗。通常應根據 AAV 載體及其表達產物的生物分布特征，選取解剖時間點，例如包括導入目的基因及其表達產物峰值時間點、穩態時間點，更長觀察期限的一般毒理學試驗中還應包括評估長期持續性及長期毒性或延遲毒性的時間點。

此外，某些情況下，藥物在組織或器官的暴露量高低與導致該組織或器官出現明顯毒性反應的時間點可能不一致，因此需基于所要考察的預期毒性反應的特點設置合適的解剖時間點。

來源：CDE

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