附件1

幽門螺桿菌耐藥基因突變檢測試劑

注冊審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對幽門螺桿菌耐藥基因檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門提供參考。

本指導原則是對幽門螺桿菌耐藥基因檢測試劑的一般要求，注冊申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供注冊申請人和技術審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究和驗證資料。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍

本指導原則適用于采用實時熒光PCR法等分子生物學技術，對來自于人體的胃黏膜組織、糞便等樣本中的幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）耐藥基因進行體外定性檢測的試劑，臨床主要用于幽門螺桿菌耐藥的輔助診斷。

申報產品的適用人群應為幽門螺桿菌感染的確診患者。幽門螺桿菌感染的確診可以為尿素呼氣試驗（UBT）、已上市幽門螺桿菌核酸或抗原檢測試劑、組織學檢測等。

幽門螺桿菌不同基因與表型的耐藥性之間符合率有較大差異，建議申請人選擇公認符合率較高的抗生素耐藥基因作為靶標，如克拉霉素耐藥基因、左氧氟沙星耐藥基因等。針對同一抗生素存在多個耐藥基因或耐藥突變位點的，申請人應考慮申報產品對耐藥基因/位點的覆蓋率。如針對同一抗生素的不同耐藥基因位點的陽性結果對用藥判斷一致，申報產品可設計為不同基因單獨檢測，結果報告為具體突變類型；也可設計為不區分具體突變類型，結果報告為耐藥/敏感。建議在產品預期用途中明確，如：本產品用于體外定性檢測來自幽門螺桿菌感染的確診患者的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括xx基因zz突變，本產品可/不區分具體突變類型。針對耐藥基因的表述，應滿足臨床通用的要求，如針對23S rRNA基因的A2142G、A2143G和A2142C點突變，針對gyrA 基因的A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G點突變等。 

幽門螺桿菌耐藥基因檢測的產品不用于幽門螺桿菌感染的輔助診斷，此類產品不用于判斷樣本中幽門螺桿菌核酸的陰性或陽性。但在產品設計中，建議針對幽門螺桿菌保守核酸序列進行檢測，檢測結果作為幽門螺桿菌耐藥基因檢測的質控，只有當該質控陽性時才能進行后續耐藥基因突變檢測結果的判定。

對于采用其他方法學或者其他樣本類型的幽門螺桿菌耐藥基因檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內容不夠全面，注冊申請人應參照本指導原則，根據產品特性對適用部分進行評價，并補充其他的評價。

本指導原則適用于幽門螺桿菌耐藥基因檢測試劑進行產品注冊和變更注冊的情形。本指導原則針對注冊申報資料中的部分內容進行撰寫，其他未盡事宜應當符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等相關法規要求，同時建議參考《定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導原則》等適用的技術文件要求。

二、注冊審查要點

（一）監管信息

1.產品名稱及分類編碼

    產品名稱應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關法規的要求，如幽門螺桿菌gyr A基因突變檢測試劑盒（PCR熒光探針法）。按照《體外診斷試劑分類規則》，該產品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.注冊申請人還需提交產品列表、關聯文件、申報前與監管機構的聯系情況和溝通記錄及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產品描述、預期用途、申報產品上市歷史及其他需說明的內容。其中，需注意以下內容：

1. 明確檢測位點的臨床意義，尤其是對于新突變位點，應提交支持檢測位點臨床意義的行業認可證據（如國內相關指南或專家共識）及支持性文獻等，詳述位點導致耐藥機制、氨基酸突變位點（如適用）、基因型與表型耐藥符合率，以及抗生素用藥背景以及中國人群數據等。

2. 檢驗原理中詳細說明產品所采用的技術原理及檢測流程，明確產品檢測靶基因及靶序列，需選擇保守性和特異性相對較高的基因和靶序列，同時還應考慮擴增效率。提供引物和探針的設計依據。提供核酸提取（手工和自動提取方式應分別明確）及檢測所用時間，提供不同適用機型的檢測通量（如適用）。

3. 預期用途需明確可檢測靶基因、對應氨基酸突變（如有）及藥物、樣本類型、采樣部位、適用人群等。

4. 與已上市同類和/或前代產品進行比較，比較內容包括方法學、檢驗原理、樣本類型、采樣部位及采樣方式、檢測靶基因、組成成分、內標、質控品、判讀規則、預期用途、適用人群、分析性能和臨床性能等方面。

（三）非臨床資料

1.產品技術要求及檢驗報告

    按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的要求編寫產品技術要求，性能指標一般包括陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、最低檢出限、精密度等，并提交三個不同批次符合產品技術要求的全項目檢驗報告。提交資料應符合《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》《醫療器械注冊自檢管理規定》等相關文件的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應當在原材料和生產工藝經過選擇和確認、質量管理體系得到有效控制并且保證產品質量穩定的基礎上，采用完整、確定的檢測系統進行分析性能評估。

對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、研究方法、試驗方案、試驗數據、統計分析等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也需在申報資料中有所體現，包括試驗地點、采用的試劑名稱、規格和批號，儀器名稱和型號，樣本類型和來源等。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、樣本采集和處理方式、稀釋方式等。研究中采用的幽門螺桿菌耐藥基因突變陽性樣本，應采用科學合理的方法確定其突變類型、突變比例/濃度水平，并提交具體的試驗資料。分析性能評估用樣本一般應為真實樣本（臨床樣本或培養菌株添加至陰性臨床樣本基質），不建議采用質粒等進行分析性能評估，如涉及稀釋后檢測，應采用與適用樣本類型一致的陰性基質進行稀釋。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。檢出限和包容性研究中所用樣本應相互獨立。

針對適用的不同樣本類型分別進行分析性能研究。

如申報產品用于不同適用機型，應采用一個或多個機型，進行充分的試劑分析性能建立研究，對于其他機型，應分析各適用機型的工作原理、檢測方法、反應條件控制、信號處理等，如基本相同，可基于風險分析對已建立的分析性能指標進行合理驗證。所有適用機型驗證的分析性能應基本一致，如不同機型對某一檢測項目的某一分析性能存在差異，應針對該差異采用不同機型進行充分的分析性能建立研究。

如試劑包含不同的包裝規格，且不同規格間存在性能差異，需采用每個包裝規格產品進行分析性能評估；如不同規格間不存在性能差異，需要詳細說明各規格間的差別及可能產生的影響，采用具有代表性的包裝規格進行分析性能評估。

建議著重對以下分析性能進行研究。

2.1樣本穩定性

對樣本穩定性進行詳細研究，包括采集后未經處理的樣本，不同的樣本采集處理方法，加入不同裂解液/消化液/保存液的樣本（如適用），研究內容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數等。

如產品適用不同的樣本類型，應對每種樣本類型進行穩定性研究。

如核酸提取液可不立即進行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和保存時間進行研究。

2.2準確度

2.2.1建議采用申報試劑與已明確型別和濃度樣本或與已上市產品或其他對比方法同時檢測臨床樣本比較耐藥基因與內控基因檢測結果之間的一致性程度。研究應納入一定數量的陰性和陽性樣本，并注意覆蓋每種突變類型。

2.2.2企業參考品驗證

根據主要原材料研究資料中的企業參考品設置情況，采用至少三批產品對企業參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數據。

2.3精密度

精密度評價應對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還包括儀器、操作者、時間、地點、檢測輪次、試劑批次等，設計合理的精密度評價周期，并對批內/批間、日內/日間、不同操作者間和不同實驗室間的精密度進行綜合評價。

針對所有待測突變位點進行精密度驗證，并采用真實樣本進行研究，同時至少采用3個濃度水平：

陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

檢出限水平樣本：待測物濃度為檢出限濃度，陽性檢出率應大于95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%，且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.5檢出限

  檢出限研究應針對所有待測突變位點進行評價。使用已明確突變位點和濃度的培養菌株，采用與適用樣本類型一致的陰性基質進行系列稀釋，進行最低檢測限的建立和驗證。建議采用數字PCR、標準曲線（通過標準物質或構建質粒繪制標準曲線）等方法進行菌株核酸濃度/突變位點濃度的確認，以copies/mL作為表示方式。明確每份菌株的來源、濃度、制備方法等信息。

2.5.1檢出限的建立

對于此類產品，擴增反應終體系中的耐藥突變序列所占百分率和總核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中耐藥突變序列所占百分率越高、所含的總DNA量越多，則越容易檢出。因此，試劑盒最低檢測限評價主要考慮以下兩個方面。

100%耐藥比例下，耐藥菌株的最低檢測濃度

將幽門螺桿菌耐藥菌株用陰性基質進行系列稀釋，制備不同濃度的耐藥菌株樣本。分別對各濃度樣本進行不少于20次的重復檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為可檢測的最低耐藥菌株濃度。

不同菌株濃度、各種耐藥比例的最低檢測限

將不同濃度野生菌株和耐藥菌株進行混合，調整野生和耐藥菌株的比例，得到含不同菌株濃度和各種耐藥比例的菌株混合液。對各份混合液進行不少于20次的重復檢測，確定95%陽性檢出率水平下的濃度水平，即在固定的核酸濃度條件下，可以檢測到的最低的突變序列百分率。

2.5.2檢出限的驗證

針對每種突變類型選擇不同于建立用臨床樣本，在已建立的檢出限水平進行至少20次的重復檢測，應滿足95%以上檢出率要求。

2.6包容性

根據試劑盒檢測范圍選擇具有時間和區域特征性的不同來源的臨床樣本或培養菌株。每種突變位點不少于5例樣本，研究應包括檢出限和重復性的驗證。

2.7分析特異性

2.7.1交叉反應

2.7.1.1常見病原體交叉反應

交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：近緣菌、易引起相同或相似的臨床癥狀微生物、感染部位附近的定植菌等。糞便樣本建議考慮空腸彎曲菌、梭狀芽胞桿菌屬 、埃希菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、變形桿菌屬、人感染其他螺桿菌 （如：海爾曼螺桿菌、鼠螺桿菌、豬螺桿菌等）；胃黏膜組織建議考慮空腸彎曲菌、變形桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸菌屬、人感染其他螺桿菌 （如：海爾曼螺桿菌、鼠螺桿菌、豬螺桿菌等）。

建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為10⁶ CFU/mL或更高，病毒為10⁵ PFU/mL或更高。

申請人應提供所有用于交叉反應驗證的微生物的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

2.7.1.2申報產品包含的不同耐藥突變位點之間的交叉反應、申報產不包含的其它幽門螺桿菌耐藥基因突變的交叉反應。

2.7.1.3其他耐藥細菌交叉：建議納入具有申報產品耐藥表型的其他細菌的交叉研究，如耐左氧氟沙星金黃色葡萄球菌等。

在交叉反應研究中，申請人除關注對耐藥基因檢測結果的影響，還應關注內控基因的檢出變化。

2.7.2干擾研究

根據所采集樣本類型，針對可能存在的內源/外源物質干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行試驗，檢測至少包含臨界陽性水平在內的幽門螺桿菌樣本。對結果進行合理的統計分析，對比添加干擾物質前后的 Ct 值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質及在樣本采集和處理期間引入的物質。

2.7.2.1內源性干擾

糞便樣本：白細胞、血紅蛋白、脂肪、腸道分泌物或粘液 、膳食纖維、多糖等。

胃黏膜組織：血液、粘蛋白、白細胞、膽汁、胃液、胃蛋白酶等。

2.7.2.2外源性干擾

抗菌藥物：克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四環素、甲硝唑、呋喃唑酮等。

其他常見治療藥物：質子泵抑制（如奧美拉唑、艾司奧美拉唑、雷貝拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑、艾普拉唑等）、鉍劑（如枸櫞酸鉍、膠體果膠鉍、次水楊酸鉍等）、鉀離子競爭性酸阻滯劑（如伏諾拉升、替戈拉生、凱普拉生等）、痔瘡膏、通便靈、鋁碳酸鎂、乳酸菌素和中成藥、促胃腸動力藥（多潘立酮、莫沙必利等）、消化酶等。

益生菌：乳桿菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌、枯草二聯桿菌，地衣芽孢桿菌等。

胃黏膜組織樣本采集和處理期間引入的物質（如去泡劑：二甲硅油、西甲硅油等）。

2.7.2.3競爭性干擾

臨床上存在多種耐藥基因突變的情況，應考慮評價高濃度分析物對低濃度分析物檢測的影響。競爭性感染的突變位點組合建議考慮同一反應體系內常見不同耐藥突變位點混合存在的情形，考察高濃度/高突變比例位點對低濃度/低突變位點檢測的影響。

2.8核酸提取/純化性能

核酸提取/純化步驟的目的除最大量分離出目標DNA外，還有相應的純化作用，應盡可能去除PCR抑制物。糞便樣本類型對PCR抑制物的去除要求較高，在核酸提取試劑的選擇中應關注。

研究確定核酸提取方法，闡述核酸提取原理，提交提取方案選擇研究資料。無論申報產品是否含有DNA分離/純化的組分，注冊申請人都應對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究。若產品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗干擾、再現性和檢出限的驗證。如果配套核酸提取試劑提取原理存在差異，還需額外進行檢出限的建立研究。

2.10反應體系

2.10.1樣本采集和處理

2.10.1.1詳述樣本采集部位、采集方式、樣本采集量的選擇，提供相關的研究資料。包括對樣本的收集、制備或處理、運輸（如涉及）和儲存的方式進行驗證，必要時進行選擇和確認并提供相關的研究資料。不同類型的樣本應分別進行研究。參考布里斯托（Bristol）大便分類法，糞便樣本建議關注對不同類型糞便的研究，如有不適合樣本（如水樣便）應在說明書明確。胃黏膜組織樣本建議關注采樣位點位置（如幽門胃竇/胃體）、數量等。

2.10.1.2樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況、用藥間隔等因素的影響。

2.10.1.3樣本處理方式的選擇：研究樣本適用的保存和處理方式，包括樣本用量、糞便沉淀/離心處理、組織研磨、蛋白酶消解等。

2.10.2核酸提取和反應體系

研究確定最佳核酸提取和反應體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積、PCR反應加樣體積及反應各階段溫度、時間、循環數等。

提交不同適用機型基線和閾值循環數的確定資料。

不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

3.穩定性研究資料

申報試劑的穩定性主要包括實時穩定性、運輸穩定性、使用穩定性等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。對于開瓶穩定性研究應模擬真實使用情形，包括開瓶穩定性的開瓶頻次和開瓶時間等。

4.陽性判斷值研究資料

陽性判斷值研究樣本來源應為預期人群，并考慮不同性別、年齡、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性，盡量納入較多弱陽性的樣本，以及一定數量的其他容易產生交叉反應的樣本。申報產品如區分突變類型，應對不同突變位點應分別進行統計分析。建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報試劑陽性判斷值，亦可采用其他科學合理的方法進行研究。如判定值存在灰區，應提供灰區的確認資料。如產品設計了內控基因用于質控幽門螺桿菌感染，也應提交內控基因陽性判斷值研究。

提交陽性判斷值建立及驗證研究資料時，應包括研究方案、設定評價標準、研究過程以及研究原始數據等。其中所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、樣本類型、臨床診斷信息、樣本來源機構、檢測結果等信息。

如果產品適用不同樣本類型，應對各樣本類型進行陽性判斷值的驗證。

提供內標檢測結果范圍的確定方法和研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

此類產品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、企業參考品、質控品等。應提供主要原材料的來源與選擇、制備過程、質量控制標準等相關研究資料、質控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業自制，應提供其詳細的制備、鑒定和質量控制過程，制備工藝應相對穩定；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、質量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的入廠檢驗報告。生產商應固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針

應詳述引物和探針的設計原則，包括對包容性和特異性的考慮情況，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應情況。產品的內控基因的引物探針建議針對幽門螺桿菌保守核酸序列設計。建議設計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對產品檢出限、包容性和特異性進行評價。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度、探針標記的熒光素及功能性試驗等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP，應提交對其純度、濃度、功能性試驗等的驗證資料，并確定質量標準。

5.1.4酶

需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶（如有）等，應分別對酶活性、熱穩定性、功能性等進行評價和驗證。

5.1.4質控品

試劑盒一般包含陰性質控品和陽性質控品。陽性質控品應包含試劑盒檢測的靶序列，可采用質粒等制備。如產品設置應用于陽性判斷值判斷的野生型陽性質控品，應考慮靶標序列的完整性。質控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制。提交試劑盒質控品有關原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質控品的檢測結果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內標

內標，又稱內對照，可對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，應與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內標的引物、探針設計和相關反應體系的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內標的檢測結果Ct值范圍。建議科學設置內標，對待測樣本的取樣質量、試劑的反應體系進行監控。

5.1.6企業參考品

該類產品的企業參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。應根據產品性能驗證的實際需要設置企業參考品。 

應提交企業參考品的原料來源、選擇、制備、耐藥位點及突變比例、濃度確認方法或試劑等相關驗證資料。企業參考品應采用臨床樣本，或者使用培養菌株加入陰性基質。企業參考品的設置建議如下：

陽性參考品：應設置不同的濃度水平，并應包括申報產品聲稱可檢測的突變位點。

陰性參考品：主要涉及對交叉反應的驗證情況，納入陰性臨床樣本、野生型幽門螺桿菌、空腸彎曲菌、檢測范圍外的其他耐藥突變位點。

檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平（應明確幽門螺桿菌核酸濃度和耐藥突變比例）。包含所有的耐藥突變位點，可采用待測幽門螺桿菌耐藥基因突變陽性培養菌株和野生幽門螺桿菌培養菌株進行適當的配制。

精密度參考品：精密度參考品應包含申報產品聲稱的主要耐藥突變位點，試劑盒包含不同反應體系時，精密度參考品應至少包含每個反應體系的代表性位點。至少包括弱陽性（低濃度突變）水平。

5.2生產工藝研究資料

生產工藝研究資料主要包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記等工藝過程的描述及確定依據。生產過程應對關鍵參數進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產工藝，標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。提交主要生產工藝的確定及優化研究資料。

2.臨床試驗方法

2.1與對比方法的比較研究

2.1.1對于已有同類產品上市的，臨床試驗應選擇已上市的同類產品作為對比試劑，評價申報產品與已上市同類產品的一致性，評價內容應包括耐藥基因及位點的檢測和相關內控基因的檢測。對比試劑的選擇應考慮檢測的耐藥基因及突變位點范圍、適用的樣本類型、產品性能等方面應與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性，選擇已上市同類產品進行臨床試驗時，對比試劑配套使用的核酸提取試劑應滿足其說明書要求。

對比方法建議選擇能夠區分不同基因及不同突變位點的產品。如臨床試驗選擇不區分突變位點的產品作為對比產品，臨床試驗還應針對對比方法檢測陽性病例采用合適的方法確認突變類型。

2.1.2對于尚無同類產品上市的，申請人可采用試驗體外診斷試劑與核酸序列測定（如Sanger測序等）方法進行對比試驗，評價兩種檢測方法的一致性，評價內容應包括耐藥基因及位點的檢測和相關內控基因的檢測。

臨床試驗資料中應對測序方法進行詳細的介紹，針對測序過程的引物設計應提供依據。明確檢測過程中配套使用的核酸提取試劑，針對測序方法提交性能驗證數據，證明測序方法與試驗體外診斷試劑的可比性。如測序試驗委托其他機構完成，還應提交由臨床試驗機構委托第三方機構/實驗室開展相關試驗的測序服務合同/協議。

2.2與藥敏試驗的比較研究

在上述比較研究的基礎上，為了進一步評價產品臨床性能，臨床試驗還應采用試驗用體外診斷試劑與幽門螺桿菌體外藥敏試驗（如E-test試驗等）進行比較研究。臨床試驗過程中選擇的微生物藥敏檢測試劑抗生素應與產品說明書預期用途中明確的抗生素一致。

3.臨床試驗受試人群的選擇

臨床試驗的受試人群應來自產品的預期適用人群，基于產品預期用途，臨床試驗入組人群應為已確診為幽門螺桿菌感染的病例。幽門螺桿菌感染的確診可以為尿素呼氣試驗（UBT）、已上市幽門螺桿菌核酸或抗原檢測試劑、組織學檢測等。

針對2.1與對比方法的比較研究(耐藥基因檢測與已上市同類產品和/或核酸序列測定方法的比對研究)，因入組病例在治療前及治療后病原體載量及耐藥情況可能存在差異，為了充分評價產品性能，建議臨床試驗針對治療前和治療后的病例均有一定數量的入組。

針對該類產品特點，產品在設計過程中包括內控基因。為了進一步評價內控基因的性能，臨床試驗需開展內控基因與已上市同類產品或核酸序列測定方法的比對，該部分研究入組人群應為疑似幽門螺桿菌感染的病例。

臨床試驗應針對耐藥基因入組一定數量的弱陽性病例。

4.臨床試驗樣本類型

幽門螺桿菌耐藥基因檢測可能涉及的樣本類型包括胃粘膜組織、糞便等。臨床樣本的采集建議按照國家衛健委發布的相關實驗室檢測技術方案執行。對于胃黏膜組織，如臨床前性能研究確認新鮮胃黏膜組織和凍存胃黏膜組織之間不存在差異，則臨床試驗可以匯總統計或以其中一種開展。

如申報產品適用于不同的樣本類型，例如胃粘膜組織、糞便等，應針對不同樣本類型分別進行臨床性能評價，包括分別進行樣本量的估算等。

5.臨床試驗樣本量

建議采用單組目標值法公式進行樣本量估算，臨床試驗陽性樣本和陰性樣本數量應分別滿足統計學要求。

5.1針對與已上市同類產品或核酸序列測定方法的對比試驗，可采用單組目標值法公式分別估算每個抗生素耐藥基因的最低陽性和陰性樣本例數。

樣本量估算公式如下，

公式中，n為樣本量；Z_1-α/2、Z_1-β為顯著性水平和把握度的標準正態分布的分數位，P₀為評價指標的臨床可接受標準，P_T為申報產品評價指標預期值。

其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標準（P₀）建議不低于90%。臨床試驗結果中，相關評價指標的95%置信區間下限應不低于預設的臨床可接受標準。當評價指標P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統計學分析，如精確概率法等。

臨床試驗中，針對產品檢測范圍內的每種突變位點均應具有一定的陽性例數。針對臨床常見的各突變位點分別不低于70例。針對臨床試驗過程中較難收集的突變位點，病例數不少于30例。

5.2針對與藥敏試驗的對比試驗，可采用單組目標值法公式分別估算每個抗生素的最低耐藥和敏感樣本例數。其中靈敏度和特異度的臨床可接受標準（P₀）的設置應滿足臨床使用需求。

5.3針對內控基因與已上市同類產品或核酸序列測定方法的對比試驗，可采用單組目標值法公式分別估算最低陽性和陰性樣本例數。其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標準（P₀）的設置應滿足臨床使用需求。

6.臨床試驗結果的統計分析

臨床試驗結果一般以四格表的形式進行總結，并據此計算試驗體外診斷試劑的靈敏度和特異度，或與對比方法的陽性/陰性符合率及其95%置信區間。

臨床試驗報告中應對入組受試者的基本情況進行分析，包括受試者年齡、性別的分布情況，以及臨床診斷背景、既往治療情況等。特別應針對用于特異性評價的各類受試者進行歸類匯總，確認入組樣本具有較好的代表性。臨床試驗中如涉及不同樣本類型，應針對每種樣本類型分別進行統計分析。

臨床試驗應針對經治療及未經治療的病例進行亞組分析，產在兩個亞組中的性能應滿足臨床要求。

臨床試驗中所有不一致結果均應結合患者的臨床癥狀、臨床診斷以及疾病治療、轉歸等信息進行充分的分析。臨床試驗結果應能夠證明產品臨床性能滿足臨床要求。

7.境外臨床試驗數據的認可

境外臨床試驗數據應符合《接受醫療器械境外臨床試驗數據技術指導原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數據的注冊審查指導原則》的相關要求。提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見，以及該數據適用于中國患者人群的論證資料、境內外臨床試驗質量管理差異的對比資料和臨床試驗質量管理差異對于臨床試驗結果影響的論證資料。

注冊申請人應根據上述臨床試驗技術審評要求，論證境外臨床試驗數據的充分性。

8.臨床證據的形式要求

申請人應按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》、《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等法規文件要求提交各機構倫理審查意見、臨床試驗方案、臨床試驗小結、臨床試驗報告以及臨床試驗數據庫。

臨床試驗數據匯總表中應提供病例的臨床診斷結果及支持病例臨床診斷結果的信息。

（五）產品說明書和標簽樣稿

產品說明書格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求。產品說明書中技術內容均應與注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，應以規范格式進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。

幽門螺桿菌耐藥基因突變檢測試劑說明書編寫應重點關注以下內容。

1.【預期用途】

1.1試劑盒用于體外定性檢測已確診為幽門螺桿菌感染的患者XX樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括xx基因zz突變，本產品可/不區分具體突變類型。

1.2 試劑盒用于XXX（抗生素）耐藥的臨床輔助診斷，為臨床醫生評估個體中幽門螺桿菌的耐藥性提供參考。

1.3適用人群：已確診為幽門螺桿菌感染的患者。

1.4簡要介紹幽門螺桿菌耐藥基因突變位點的特征，包括突變位點的描述，所檢測的耐藥突變位點與相應藥物的相關性。

1.5強調該試劑盒檢測結果僅供臨床參考，不應作為治療藥物調整的唯一依據，臨床醫生應結合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素對患者治療進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

簡述核酸提取純化及試劑盒檢測原理，說明檢測的耐藥突變位點信息，明確內標基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，進行簡要描述。如可進行幽門螺桿菌陰陽性判定，應對其原理簡要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分，明確需要但未提供的材料，如核酸提取試劑、樣本保存液及其他配套使用的材料的產品名稱、生產廠家、貨號及注冊證號或備案號等信息。

4.【樣本要求】

明確樣本采集時間點的選擇，是否受臨床癥狀、用藥情況、用藥間隔等因素的影響等。

詳細描述樣本采集、保存、運輸和處理方式，包括采樣步驟，采樣量，保存液使用體積等。如有臨床公認推薦的采樣要求，應遵循，并引用相應的技術規范或指南。描述樣本及核酸提取液的保存穩定性。

5.【檢驗方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰陽性質控品與待測樣本同步進行核酸提取操作。明確各適用機型的反應參數設置，基線、循環閾值（Ct值）的選擇方法，以及各檢測靶標對應的熒光通道。明確內標、質控的檢測結果Ct值范圍。

6.【陽性判斷值】

簡述陽性判斷值確定的方法，包括研究人群特征、研究樣本量和統計分析方法等。

7.【檢驗結果的解釋】

通過擴增曲線和Ct值進行結果陰陽性的判斷，列明結果陰性、陽性、灰區、復測、無效等所有情形。

8.【檢驗方法局限性】

8.1本試劑檢測結果應結合患者臨床癥狀及其他相關醫學檢查結果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據。

8.2 本產品僅檢測靶標區域內突變引起的耐藥。由其他基因或基因區域的突變、以及其他耐藥機制引起的耐藥本產品不能檢出。

8.3導致假陰性/假陽性結果的可能性分析：

8.3.1不合理的樣本采集、處理、運輸及保存條件，樣本中目標物濃度過低。

8.3.2 待測目標基因序列的變異或其他原因導致的序列改變。

8.3.3耐藥基因型與表型存在一定的不一致性。

8.3.4未經驗證的其他干擾，如內源性或外源引入樣本的物質。

8.3.5是否受用藥影響，明確與根除治療或其他經驗用藥的時間間隔。

9.【產品性能指標】詳述以下性能指標：

簡述試劑性能指標和研究情況，建議包含：參考品的符合性、準確性、檢出限、包容性、精密度、分析特異性、臨床試驗等。

10.【注意事項】應至少包括以下內容：

10.1試劑保存運輸及使用過程中多種因素可能導致性能變化，如保存運輸不當、樣本采集、樣本處理及檢測過程操作不規范等，請嚴格按照說明書操作。

10.2生物安全防護相關內容

10.3避免實驗室污染的措施

    三、參考文獻

[1] 國家藥品監督管理局. 關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告: 國家藥品監督管理局公告2021年第122號[Z].

[2] 國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心.體外診斷試劑說明書編寫指導原則（2023年修訂版）: 國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心公告2024年第1號[Z].

[3] 國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心.定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導原則: 國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心公告2022年第36號[Z].

[4]中華醫學會消化病學分會幽門螺桿菌學組. 2022中國幽門螺桿菌感染治療指南[J].中華消化雜志,2022,42(11):745-756. 

[5] Malfertheiner P, Megraud F, Rokkas T, et al. Management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht VI/Florence consensus report. Gut 2022; 71:1724–1762.

[6] 中華醫學會腫瘤學分會早診早治學組. 胃癌早診早治中國專家共識（2023版)[J]. 中華消化外科雜志, 2024, 23(1): 23-36.

來源：CMDE

原文下載：幽門螺桿菌耐藥基因突變檢測試劑注冊審查指導原則（征求意見稿) .docx