人用基因治療制品總論

概述

人用基因治療制品通常由含有工程化基因構建體的載體或遞送系統組成,其活性成分可為DNA、RNA、基因改造的病毒、細菌或細胞，通過將外源基因導入靶細胞或組織，替代、補償、阻斷、修正特定基因，以達到治療疾病的目的。

依據載體的不同，可將人用基因治療制品分為以病毒為載體的人用基因治療制品，以質粒DNA為載體的人用基因治療制品，以及以細菌為載體的人用基因治療制品等，其中以病毒和質粒DNA為載體的人用基因治療制品為常見。

本總論是對人用基因治療制品生產和質量控制的通用性技術要求,重點針對以病毒和質粒DNA為載體的基因治療制品，用于基因修飾細胞(在輸入受試者或病人之前用基因治療載體進行離體或體外修飾的自體或異體體細胞)的載體也適用于本總論，具體品種還應結合制品本身的特性制定相關要求。

2 制造

2.1 基本要求

人用基因治療制品的制造主要包括生產用起始原材料、原材料和輔料的控制，載體的制備,目標成分的提取、純化和制劑等過程。生產過程中使用的菌毒種和動物細胞基質應符合"生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制"和”生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制”的相關要求。使用的原材料和輔料應符合“生物制品生產用原材料及輔料質量控制”的相關要求。應采用經過驗證的生產工藝進行生產，并對生產工藝全過程進行控制。

2.2 載體的設計與構建

應基于制品的臨床有效性和安全性進行載體的設計與構建。通常基于基因治療制品的作用機制,如通過編碼功能性蛋白質的轉基因表達，或采用RNA干擾、小RNA或基因編輯等方式,采用基因沉默、外顯子跳躍、基因調控或基因敲除等方式修復、添加或刪除特定的基因序列，進行載體的設計與構建,

基因治療制品中使用的載體可以設計為靶向特定組織或細胞，或刪除與毒力、致病性或復制能力相關基因的病毒,以確保制品的安全性。

用于基因治療制品的常見的載體系統是病毒載體和質粒DNA載體。病毒載體可分為非復制型、條件復制型或復制型，每種類型在設計時都應針對安全件方面進行特別考慮，采用非復制型載體要洗擇盡可能少產牛復制活件病毒或能夠有效避免輔助病毒風險的方法。質村DNA載體應考慮抗牛素抗件基因可能給病人帶來的風險和危害，且不得使用氨芐西林抗性基因。

23起始原材料

用于基因治療制品生產的起始原材料主要包括生產用細胞、細菌或病毒種子。用于生產的細胞、細菌或病毒種子的來源和歷史應清晰，應建立至少兩級細胞庫和/或細菌/病毒種子批系統。

應對所有起始原材料進行充分鑒定并建立明確的質量控制要求，確保無細菌、真菌、病毒和支原體等微生物污染。應保證起始原材料的遺傳穩定性并基于細胞庫/種子批經長時間培養或多次傳代后產物的完整性和一致性，以及其表型和基因型特征等確定生產用細胞庫/種子批的最高限度代次

以下是對生產用起始原材料質量控制的一般要求，對不同的制品和生產工藝還需結合具體情況考慮,

病毒種子批231

病毒種子批質控項目的確定應根據種子批建立的特定情況以及病毒種子本身的相關特征，基于風險分析進行評估。主種子批的質控項目通常包括鑒別(基因擴增、限制性內切酶酶切圖譜和免疫血清學檢測等)、病毒滴度，治療序列的轉錄/表達(如適用)、治療席列或表達產物的牛物活件(如適用)、無菌檢査(細菌和真菌)、支原體檢査、外源病毒因子檢査、復制型病毒(制品本身為復制缺陷型或條件復制型)等。主種子批確定無外源因子污染時，其工作種子批只需檢測該制備過程中可能引入的外源因子污染;如因主種子批數量限制而無法進行全面的外源因子檢查時，應對工作種子批進行全面檢定。外源病毒因子應符合"外源病毒因子檢査法”的相關要求,同時還應對種子批歷史傳代過程中可能污染的特定外源病毒因子進行檢測，除另有規定外，應對病毒基因組的完整序列進行分析，或至少應確認重要區域(如治療和調控元件,以及被人為修改的仟何區域及其側翼至少0.5kb內的區域)的序列與理論預期相符、在特定情況下因基些位點產生突變造成序列與理論不符，應得供不影響目的基因表達和制品質量的證據。應證明生產用病毒種子批的遺傳穩定性、目的基因表達穩定性和生產穩定性，

2.3.2 生產/包裝細胞庫

生產/包裝細胞系進行的檢測應符合"生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制"的相關要求，通常包括鑒別及純度、基因分型/表型、遺傳穩定性等，另外，在適用的情況下還應檢測成瘤性/致癌性、引入序列的鑒別和完整性以及拷貝數等。

生產/包裝細胞庫內、外源病毒因子檢査應按本版藥典相關通則進行。應確定無細菌、真菌、支原體和螺原體(昆蟲細胞)等污染,

233細菌種子批

細菌種子批的質控項目通常包括菌落形態、染色鏡檢、生化特性、抗生素抗性檢査、電鏡檢査、質粒限制性內切酶酶切圖譜分析等。應確保不存在其他細菌、真菌和噬菌體的污染。應檢測細菌種子批多次傳代后的基因型和表型的穩定性。此外,對于基因修飾的細菌，其基因組重要區域(如引入的治療和調控元件，以及被人為改造的任何區域及其側翼至少0.5kb內的區域)的序列應與理論預期相符。在特定情況下因某些位點產生突變造成序列與理論不符時，應提供不影響目的基因表達和制品質量的證據。對于經基因改造的質粒不大于50kb的，應進行全序列測定。對于轉導質粒的細菌種子批，應檢測質粒拷貝數和有/無質粒細菌的比例。對于生產質粒用途的細菌種子批，應檢査質粒產率。對于引入的治療基因，應檢測其表達水平和功能活性。對于減毒細菌載體，應鑒定其減毒的特性和穩定性，并檢測其對抗生素的敏感性。

2.3.4 質粒DNA

對用于瞬時共轉染生產過程的質粒DNA,需對其來源、特性、分離純化方法以及核酸序列等進行描述,對質粒DNA的復制起始點、啟動子以及編碼選擇性標記的基因等組成元件的來源和功能進行說明。質粒的生產應基于細菌種子批系統，并符合相關要求。應采用適宜的方法純化質粒，并基于風險分析和產品特性對每批質粒的質量進行檢測，通常包括鑒別、基因組完整性、質粒含量、質粒純度、宿主細胞DNA殘留量、質粒對細胞的轉染效率或其他可反腫轉染效率的檢測項目，如細菌內毒表檢育和無菌檢音等，檢測結果符合要求后才能用干載體的生產,

2.4 原材料及輔料

生產過程中所使用的原材料及輔料應符合“生物制品生產用原材料及輔料質量控制"的相關要求。對可能影響制品安全性的相關原材料(或渚如輔助病毒/包裝序列或介質等原材料的組成部分)，應評估其在最終制品或工藝最適階段中的殘留情況，并根據具體情況確定其殘留限度。

輔助病毒涉及病毒種子批系統的設計、構建、生產和使用等應符合2.3.1項相關要求。

來源干動物組織或體液的原材料應嚴格控制外源因子污染的安全性風險。生產過程中不得使用青霉素等8-內酰胺類抗生素和鏈蛋素,以及其他如溴化乙錠等有毒試劑。

用作病毒或DNA載體遞送系統的復合材料必須符合其預期目的，并具有良好的工藝穩定性和產品穩定性。應根據其具體性質和對制品的影響情況進行適當鑒定，并建立相應的檢測方法和質控要求。

生產過程的控制

生產工藝應穩定可靠，并有明確的過程控制參數，以確保制品安全、有效和全程質量可控。生產工藝的確定應建立在對目標制品的質量屬性、生產工藝的深入理解和全面設計基礎上。應根據研發早期到規模化生產的整個工藝周期的相關信息,確定原液和成品生產的關鍵步驟，并依據制品的關鍵質量屬性，確定工藝參數和過程控制項目，并制定相應可接受標準進行控制，以確保工藝過程的重現性及制品質量的批間一致性。

2.5.1 病毒/細菌培養物的制備

2.5.1.1 病毒培養物的制備

(1)細胞培養 將工作細胞庫細胞按規定傳代,同一種病毒生產用的細胞擴增應盡可能按相同的消化程序、分種擴增比率、培養時間及培養條件進行傳代。在病毒種子或產品的外源病毒因子檢育因制品病毒不能被充分中和而受到干擾等情況下,應在生產中設置對照細胞,對照細胞的外源病毒因子檢査應符合本版藥典的要求。采用生物反應器微載體培養的應按固定的放大模式擴增，并建立與生物反應器培養相適應的對照細胞外源因子檢查。細胞培養過程中需監測細胞的生長狀況，并根據生產系統的特點確定監測頻率及指標。

(2)病毒增殖和收獲 接種病毒時應明確病毒感染性滴度與細胞的最適比例,同一工作種子批按同一MOI接種，采用多質粒瞬時轉染或加入輔助病毒等生產病毒的方式，也應明確加入量與細胞的最適比例。

應根據生產過程中培養、增殖和產物產量一致性的研究資料，確定終止培養、收獲產物的技術參數。每次收獲后應檢測目標產物含量、細菌內毒素支原體等。應根據生產過程及所用材料的特點，在適宜的階段進行常規或特定的外源病毒污染檢查。

來源于同一細胞批的單次病毒收獲液經檢驗合格可合并進行純化。多次收獲的病毒培養液,如單一培養容器出現污染,則與該污染容器相關的病毒收獲液均不得用于生產。

2.5.1.2 細菌培養物的制備

(1)細菌培養 將工作種子接種于規定的培養基進行培養擴增。自菌種開啟到菌體收獲應有明確的擴增次數規定。細菌培養過程中可進行細菌純度細菌總數、DH值及耗氧量等監測。

(2)菌體的收獲 根據不同的培養方式采用適宜的方法收獲菌體。培養物收獲后應進行細菌純度、細菌總數、活菌含量等檢測。

2.5.2提取和純化

采用的分離純化方法或技術，應能適應于規模化生產并保持穩定。應對純化工藝中可能殘存的有害物質進行嚴格控制，包括固定相或流動相中的化學試劑、各類親和色譜柱的脫落配基或抗體以及可能對目標制品關鍵質量屬性造成影響的各種物質等。

純化工藝應保證將制品的一些特定工藝雜質去除或降低至可接受的水平,包括來自表達載體的核酸、宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、污染的外源醫子、細菌內毒素、核酸酶以及源自培養液的各種其他殘留物等。

2.5.3 原液

收獲液經提取、純化后分裝于中間貯存容器中即為原液。如需加入穩定劑或賦形劑，應不影響質量檢定，否則應在添加輔料前取樣進行原液檢定。原液的檢測項目取決于工藝的驗證,一致性的確認以及預期的制品相關雜質與工藝相關雜質水平。應采用適當方法對原液質量進行檢測，必要時應與標準物質進行比較。原液如需貯存，應通過制品穩定性驗證確定貯存條件和時間

2.5.4 復合工藝控制

對于復合的基因治療制品(如載體或基因構建體與高分子聚合物、聚陽離子、納米材料、脂質、蛋白質等形成復合物或相連接)，其復合材料的生產以及復合的過程應根據具體的產品情況和工藝特點設置適宜的工藝參數和過程控制要求，以保持工藝穩定性和產品質量的一致性。

2.5.5 半成品

除另有規定外，制備成品前，如需對原液進行稀釋或加入其他輔料制成半成品，應確定半成品的質量控制要求，包括檢定項目和可接受的標準

2.5.6 成品制劑

制劑生產應符合本版藥典和中國現行《藥品生產質量管理規范》的相關要求。

2.5.7 包裝及密閉容器系統

直接應用于人體的基因治療制品原液和成品與容器的相容性應符合相關要求。此外，應采用適宜方法對容器完整性進行檢測，防止容器泄漏導致制品無菌狀態的破壞。

2.6 生產工藝變更

生產工藝變更應符合國家藥品注冊管理等相關要求。涉及重大生產工藝的變更,應對變更前后的制品質量、安全性和有效性進行比較和評估，以證明變更前后制品特性的高度相似，并確保任何質量屬性方面的改變對制品安全和有效性無負面影響。

3特性分析

應采用先進的分析手段，從生物學、分子生物學、免疫學、物理化學等角度,對人用基因治療制品的基因型和表型、純度、治療序列活性/生物效價、感染性/轉導效率和預期用途的適用性等進行全面的分析，并提供盡可能詳細的信息，以反映目標制品內在的質量屬性，并作為建立和制定上市制品質量標準的基礎。特性分析應包括對原材料、中間體、原液和成品特性的分析。對于復合核酸載體，應充分研究載體、復合組分和復合物的特性。特性分析數據可能來自整個開發和(或)制造過程。對于不同階段(開發、試生產、完整規模生產等)生產的產品批次可根據不同情況開展適宜程度的特性分析研究，其中用于制定上市制品質量標準的產品批次工藝應代表預期的上市制品工藝。

特性分析一般在研發階段進行，并通過生產工藝的優化，以及具有代表性的足夠批次制品的周期性監測加以完善特性分析至少應包括以下內容。

結構分析3.1

應對治療序列的選擇/調節/控制作用涉及的基因完整序列進行分析，并進行適宜的限制性內切酶酶切圖譜分析,以補充鑒定轉錄/翻譯元件和開放閱讀框以及其余載體序列。應檢測重組載體基因組或質粒的完整性和均一性,進行載體遞送的治療序列和選擇/調節元件的表型鑒別和分析。對干病毒載體，適當情況下應測定插入位點，并充分評估插入突變的可能性和相關風險;對于質粒，應確認復制起點的位置以及是否存在CpG序列(如果與制品的設計相關);對于細菌載體，應確認是否存在涉及制品安全性的插入/刪除序列;對于轉導的細菌載體，應檢測質粒和相關調控/控制元件的存在及序列。

3.2生物學活性

應依據制品的作用機制，盡可能確定與療效最為相關的質量屬性,并建立相應的檢測方法。應證明替代、補償、阻斷、修正特定基因的預期作用，對于含有多種活性成分的制品，需要分別建立方法對各個成分的活性進行測定,同時還應考慮活性成分之間可能存在的干擾或協同等作用。在相關細胞類型中分析載體的轉導效率和/或拷貝數、轉基因表達水平、相關生物活性以及與載體或遞送系統的作用機制相關的因素。應分析預期的病毒載體的宿主范圍和組織嗜性，或復合核酸遞送的選擇性，以及轉基因表達的選擇性。

3.3 純度、雜質和污染物

人用基因治療制品雜質主要包括工藝相關雜質、制品相關雜質以及外源污染物。應盡可能地對雜質進行分析鑒定，并采用適宜的方法評估其對生物學活性和安全性的影響。在復合核酸的情況下，應考慮到復合物合成和生產所產生的副產品/雜質對復合物的安全性和性能的影響。

3.3.1 工藝相關雜質

工藝相關雜質來源于生產工藝本身，主要包括起始原材料來源(如殘留宿主細胞DNA和殘留宿主細胞蛋白質等)原材料來源(如培養試劑、純化試劑、輔助病毒和輔助病毒核酸等)和設備材料來源(如工藝中的可漫出物和可提取物、色譜填料脫落物等)的雜質,應對潛在的工藝相關雜質進行鑒定、評估，并進行定性和/或定量分析，

3.3.2 制品相關雜質

應盡可能鑒定具有缺失、重排，雜交或突變序列的載體等制品相關雜質,如可行，應對其進行定量。必要時,應對載體中可能存在的共包裝非目標DNA序列進行確認。應分析生產過程中潛在的載體降解情況，如測定非感染性載體、轉導效率降低的質粒，或核酸復合物經過氧化或解聚等的降解形式。在設計為復制缺陷型或條件復制型載體的情況下，應分析是否存在殘留的復制型或野生型載體及其水平

3.3.3 污染物

污染物系指所有引入日并非生產過程所需的物質(如各種微生物、細菌內毒素)。應嚴格避免引入污染物并對其進行相應控制。

3.4 含量

應建立基因治療制品物理數量和生物數量的含量檢測指標。可以通過諸如總顆粒數、感染性滴度或感染性顆粒數、基因組DNA/RNA或質粒DNA濃度等的檢測來確定含量。可通過物理、生物物理等方法來測量顆粒的物理數量，或測量病毒顆粒內已知分子量和拷貝數的某種代表性的結構蛋白來評估病毒顆粒數。感染性滴度或感染性顆粒數可采用噬斑形成單位(PFU)、半數組織培養感染劑量(TCID50)等基于細胞的體外檢測方法。對于病毒載體，應控制總顆粒數或基因組拷貝數等物理數量與感染性滴度或感染性顆粒數的比例。應盡可能使用標準品或對照品來校準含量測定結果。通過方法學研究確定用于制品放行檢定的含量測定方法。

3.5 其他特性

通常應評估顆粒或分子大小的平均值和分布、聚集體以及折射率等多種理化和其他特性及其與制品安全、有效性的關系，必要時應將其納入制品檢定項目中。

病毒載體類基因治療制品，還應對病毒的感染性、毒力、復制能力等特性進行分析。應分析載體脫落、載體復制、插入突變、內源性病毒再激活或與內源性病毒互補的可能性，以及對安全性的影響。

復合核酸類基因治療制品，其復合物的結構以及載體和帶負電荷的DNA之間的相互作用可能影響制品的安全性和有效性，應充分鑒定復臺/遞送系統的性質，包括結構形式、粒度分布、表面電荷、在特定情況和生物環境中的穩定性,以及復合結構內的核酸分布，通過特性研究確定的與關鍵質量屬性相關的特性，如對預期用途有重要影響的復合核酸的生物化學和生物學特性，應建立適宜的方法并納入制品放行檢定項目。

細菌載體類基因治療制品，應測定其質粒拷貝數和含/不含質粒細菌的比例。應分析表型、免疫學特性(包括選傳修飾的細菌成分)以及由細菌載體遞送的治療序列和選擇/調控元件等。

標準物質4

對于效價、感染性滴度等活性檢測方法，應建立具有長期穩定性的活性標準品/參考品。對于鑒別試驗、顆粒數等各種理化分析，可選擇已證明足夠穩定目適合臨床試驗的一個(多個)批次，或用一個代表批次作為參考品/對照品，并應按特性分析要求進行分析鑒定。在采用PCR或定量PCR方法的檢定項目中所用到的質粒DNA或核酸對照品，在制備和分裝后應進行適官的分析定標準品/參考品/對照品的建立和制備可參照"生物制品國家標準物質制備和標定"的相關要求。

5制品檢定

應根據制品關鍵質量屬性、對制品和工藝的深入了解和風險評估的原則,制定相應質量控制策略。制品檢定采用的檢測方法應經驗證或確認并符合要求。納入質量標準的檢定項目、可接受限度，應結合特性分析數據、臨床前和(或)臨床研究多批次樣品的數據、工藝驗證批次的數據、穩定性研究數據等綜合確定。基因治療制品的質量檢定至少應包括以下項目，但對不同的制品和生產工藝還需結合具體情況加以考慮。

5.1鑒別試驗

根據人用基因治療制品的情況，應在核酸序列水平采用限制性內切酶酶切圖譜分析、PCR、RT-PCR和核酸序列測定等方法對載體組成、治療序列、缺失片段以及其他影響治療序列表達的重要部分進行鑒定;同時在蛋白質水平采用蛋白質電泳、免疫印跡、免疫中和試驗等方法，對結構蛋白、表達產物、免疫標記、表型特征等進行鑒別。對于復合的核酸制品，應對相應的脂質等復合成分進行鑒別試驗。鑒別試驗應設置適宜的陽性和陰性對照。

5.2純度和雜質

應采用類似正交組合的方法來評估制品的純度/雜質，

5.2.1 總純度

適用的情況下，應采用HPLC、SDS-PAGE、紫外吸收(如Az60/A28o比值測定)等方法評估產品的總純度水平

5.2.2 工藝相關雜質

對于工藝相關雜質，應檢測細胞來源的污染物的殘留水平,例如來自包裝細胞系或細菌的宿主細胞蛋白和宿主細胞DNA。對于生產中使用了輔助病毒、質粒DNA、牛血清、核酸酶、抗生素等的制品,還應分別檢測其殘留量或殘留活件。如在生產中使用了其他對人體有害的試劑,如有機溶劑等也應在制品中進行相應的檢測。生產過程如使用致瘤細胞系，殘留DNA水平應嚴格控制并保持在最低水平。經充分驗證證明生產工藝對工藝相關雜質已有效控制或去除，并達到可接受的水平，相關殘留物的檢定項目可不列入成品的常規放行檢定中。

5.2.3 制品相關雜質

對制品相關雜質的檢測包括非功能形式的載體、共包裝的無用基因序列等。例如，在可能的情況下，應控制病毒載體的空殼粒數和聚集體，對于質粒DNA，應控制不同質粒形式的比例等。采用復制缺陷型或條件復制型病毒載體時，應對復制型病毒或野生型病毒進行檢測，且殘留水平應控制在一定限度，限度標準應依據制品的非臨床和(或)臨床數據確定;明確具有較大臨床安全性風險的，應證明制品中不存在復制型病毒或野生型病毒。

效價3

根據制品特性，應至少建立一個反映療效的生物效價指標。效價測定通常包括對基因轉移效率(感染性/轉導效率/傳遞效率)、治療序列表達的水平、表達產物的功能或整個制品的直接活性(例如腫瘤細胞殺傷活性等)的測定。效價測定應盡可能采用定量的方法;首選體外生物效價檢測方法如體外感染、轉染或轉導易感細胞后，對表達產物的功能測定(如測定酶活性、細胞牛長的刺激或抑制等)。當轉基因表達的牛物學功能表現出的法性范圍過寬或僅能產生半定量甚至僅為定性結果時,可采用酶聯免疫吸附法(ELSA)或其他定量方法測定治療序列的表達水平,作為補充的效價測定方法。體外方法不可行時，可采用動物離體組織或動物體內檢測方法，必要時可采用轉基因動物或移植了人體組織或系統的動物。效價測定需要采用相應的活性標準品或參比品，用于計算供試品的相對效價或作為對照。

5.4 含量

根據制品組成情況，應對總顆粒數、感染性滴度或感染性顆粒數、基因組DNA/RNA或質粒DNA的量或濃度進行適宜的組合來測定原液和成品的含量，并用標準品/參考品進行比較計算或作為對照。在制品為病毒載體的情況下,還應進行總顆粒數或基因組拷貝數等物理數量與感染性滴度比例的測定和控制。

股安全性試驗

根據制品特性而定，應至少包括無菌檢査、細菌內毒素檢査、異常毒性檢查等,

5.6 其他檢測項目

應根據相關制品的特性和劑型而定。檢測應包括但不限于外觀(例如性狀、顏色)、澄清度、可見異物、不溶性微粒、pH值、滲透壓摩爾濃度、裝量、水分、賦形劑、粒度和粒度分布、乳光、折射率、zeta電位、包封率、釋放效應等。

6貯存、有效期和標簽

制品貯存應符合”生物制品分包裝及貯運管理”規定，成品應在適合的環境條件下貯存和運輸。自生產之日起，按批準的有效期執行。標簽應符合“生物制品分包裝及貯運管理”要求和國家相關規定，標示內容至少應包括:

(1)制品名稱;

(2)每瓶的活性單位(如必要);

(3)每瓶有效成分含量;

(4)每瓶標示體積(液體制劑);

(5)批號和有效期

來源：藥典委